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安徽醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心

中國藥科大學(xué)藥物分析系

基因毒性雜質(zhì)危害性大，需要嚴(yán)格控制其在藥物中的限度，保障用藥安全。基因毒性雜質(zhì)的檢測面臨雜質(zhì)種類多和化學(xué)性質(zhì)活潑等問題，分析方法復(fù)雜多樣，從而對藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測方法提出了很高的要求。

本文從基因毒性雜質(zhì)的研究思路、來源、分類、限度、檢測方法和研究難點(diǎn)6 個方面進(jìn)行總結(jié)分析，為藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測提供借鑒。

影響藥品純度的物質(zhì)被稱為雜質(zhì)，藥品中的雜質(zhì)一般沒有治療作用，有的會影響藥物的穩(wěn)定性和療效，甚至導(dǎo)致不良用藥事件的發(fā)生［1-3］。

藥物中雜質(zhì)來源主要有兩方面: 

① 在藥物的生產(chǎn)過程中引入。

②由儲藏或運(yùn)輸過程中受到外界條件的影響，導(dǎo)致藥物理化特性發(fā)生變化而產(chǎn)生［4］。

Ashby 等［5］在研究了300 多種化合物對DNA活性影響研究的基礎(chǔ)上，首次提出了基因毒性的概念。

基因毒性雜質(zhì)( genotoxic impurity，GTI) 定義為“經(jīng)過適當(dāng)遺傳毒性實驗?zāi)Ｐ停缂?xì)菌基因突變( Ames) 實驗，證實具有遺傳毒性的雜質(zhì)”。

該類雜質(zhì)可能從基因突變、染色體畸變、DNA 損傷與修復(fù)等幾個方面同DNA 發(fā)生直接或間接的相互作用，從而改變DNA 結(jié)構(gòu)與構(gòu)象或引起DNA 的損傷，進(jìn)而影響DNA的功能或改變其遺傳特性，最終引起突變、癌變、畸變等遺傳毒性［6-8］。

關(guān)于藥物中基因毒性雜質(zhì)超標(biāo)導(dǎo)致藥品召回的事件均有報道，各國藥品監(jiān)督管理部門對藥物中基因毒性雜質(zhì)的控制出臺了一系列的指導(dǎo)文件，旨在嚴(yán)格控制該類雜質(zhì)在藥物中的限度。

本文從基因毒性雜質(zhì)的研究思路、來源、分類、限度、檢測方法和研究難點(diǎn)6 個方面進(jìn)行分析和總結(jié)，為該類雜質(zhì)的研究提供一定的理論依據(jù)和參考。

1、基因毒性雜質(zhì)的研究思路

將藥物中的基因毒性雜質(zhì)完全除去實際操作難度很大，ICH，EMA 和FDA 均頒布了相關(guān)的基因毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)文件，推薦以毒理學(xué)關(guān)注閾值( threshold of toxicological concern，TTC，1.5 μg·d-1 )來控制用藥風(fēng)險。

TTC 具體含義為在人的一生( 70歲) 中，每天攝入1.5 μg 基因毒性雜質(zhì)，其致癌的風(fēng)險是可接受的( ＜ 1 /100 000) 。

所以在實際的檢測中，基因毒性雜質(zhì)采用限度檢查的方法。藥物中基因毒性雜質(zhì)的具體研究思路如下:

① 根據(jù)藥物合成工藝中使用的起始物料、試劑和催化劑等，結(jié)合可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)推測藥物中可能引入的基因毒性雜質(zhì)并對其進(jìn)行分類。

② 確定雜質(zhì)可接受的最大限度。

③ 開發(fā)藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測方法。

④ 建立專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析速度快的分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗證。

⑤ 對供試品進(jìn)行測定，確認(rèn)樣品中基因毒性雜質(zhì)的限度是否符合要求。

根據(jù)研究思路、待測物的性質(zhì)和各種檢測手段的特點(diǎn)，總結(jié)出基因毒性雜質(zhì)的研究決策樹［9］，見圖1。

藥物中基因毒性雜質(zhì)的來源有原料藥合成的起始物料、反應(yīng)中間體、催化劑和試劑等。

此外，在藥物的合成、制劑生產(chǎn)、儲存或運(yùn)輸過程中也會生成基因毒性雜質(zhì)［10］，所以藥物中基因毒性雜質(zhì)的來源貫穿藥品的生產(chǎn)和流通整個過程。

本文將藥物中基因毒性雜質(zhì)的來源分為3 類［9］:

 ① 基因毒性試劑( genotoxic reagents) : 藥物在合成過程中使用的原料、反應(yīng)試劑或催化劑，其本身具有警示結(jié)構(gòu)，在合成反應(yīng)過程中未反應(yīng)完全而引入到中間體或藥物粗品中。

② 基因毒性合成產(chǎn)物( genotoxic synthetics) :在藥物的合成過程中，2 個或多個合成物料或試劑在一定化學(xué)反應(yīng)條件下生成具有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，該類雜質(zhì)可能是副產(chǎn)物也可能是藥物合成中間體。

③ 基因毒性降解產(chǎn)物( genotoxic degradants) : 原料藥或制劑本身不具有警示結(jié)構(gòu)，但在儲存或運(yùn)輸過程中發(fā)生氧化或還原等反應(yīng)，最終生成具有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)。藥物中基因毒性雜質(zhì)的來源示意圖和舉例分別見表1 和圖2。

基因毒性雜質(zhì)申報資料的監(jiān)管已經(jīng)得到藥監(jiān)部門的重視，F(xiàn)DA，ICH，EMA 和CFDA 均對藥品申報文件中有關(guān)基因毒性雜質(zhì)的控制提出嚴(yán)格的要求。

為確定某種物質(zhì)是否具有基因毒性，目前主要通過毒理學(xué)評估手段，以體外Ames 實驗為主，輔以部分體內(nèi)實驗進(jìn)行補(bǔ)充［11］。

自然界中化合物的種類成千上萬，對藥物合成過程中所涉及的化合物均進(jìn)行毒理學(xué)評價，判別它們是否為基因毒性雜質(zhì)的方法成本高、周期長，在實際研究工作中難以開展。

通過化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與毒理學(xué)活性相關(guān)方面的研究，某些官能團(tuán)或者亞結(jié)構(gòu)單元，能與生物體內(nèi)一些功能性的大分子發(fā)生反應(yīng)，引起基因突變，這些官能團(tuán)或者亞結(jié)構(gòu)單元對生物活性具有警示作用，統(tǒng)稱為“警示結(jié)構(gòu)”［12］。

在研究中利用這種“警示結(jié)構(gòu)”來判斷化合物是否具有基因毒性，使得藥物中基因毒性雜質(zhì)的確定更迅速、研究更具有針對性，極大方便了藥物中基因毒性雜質(zhì)的研究工作。

Ashby 等［13］總結(jié)了一些易致癌化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，并提出了具有18 種警示結(jié)構(gòu)的化合物模型即“超級致癌物”，見圖3。

EMA 和FDA 指南都認(rèn)為使用結(jié)構(gòu)評估是研究藥物中基因毒性雜質(zhì)的一種有效的方法，常用的結(jié)構(gòu)評估商業(yè)軟件有DEＲEK 和Mcase 等，也可以使用基于Ashby 和Tennant 簡單的警示系統(tǒng)［14］，結(jié)合相關(guān)資料和研究，將警示基團(tuán)分20 類列出，見表2。

FDA 還推薦使用MC4PC 等軟件對化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)評估，以對化合物的毒性進(jìn)行更準(zhǔn)確的衡量，對藥物中基因毒性雜質(zhì)研究提供參考［15］。

如果雜質(zhì)沒有被基因毒性標(biāo)記，但在工藝中作為親電試劑使用，仍需要通過數(shù)據(jù)庫查詢確定其是否具有基因毒性，如美國醫(yī)學(xué)圖書館的TOXNET 數(shù)據(jù)庫等，其提供了許多常見化學(xué)品的安全性數(shù)據(jù)［14］。

應(yīng)當(dāng)注意，含有警示結(jié)構(gòu)并不意味著該物質(zhì)一定具有遺傳毒性，而確認(rèn)有遺傳毒性的物質(zhì)也不一定會產(chǎn)生致癌作用。

物質(zhì)的理化性質(zhì)和其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(如相對分子質(zhì)量、親水性、分子對稱性/空間位阻、反應(yīng)活性以及生物代謝速率等) 可能會對其毒性產(chǎn)生抑制或調(diào)節(jié)作用。

警示結(jié)構(gòu)的重要性在于它提示了可能存在的遺傳毒性和致癌性，為雜質(zhì)進(jìn)一步的安全性評價和控制策略的選擇指明方向［16-18］。

4、基因毒性雜質(zhì)的限度

2004 年EMA 發(fā)布的基因毒性雜質(zhì)限度指南( 草案) ，采用“最低合理可行”的概念，默許全面消除風(fēng)險是無法實現(xiàn)的，因此建議采用毒理學(xué)關(guān)注閾值TTC 作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度［16］。

TTC概念的應(yīng)用允許在無任何體內(nèi)數(shù)據(jù)時，在足夠的安全性基礎(chǔ)上建立雜質(zhì)控制限度。

TTC 的應(yīng)用有利于企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)，使其避免做不必要的毒理學(xué)研究和安全性評估。

然而，該草案沒有明確短期臨床試驗的允許限度，在某些短期臨床研究中，也被迫接受TTC 的終生暴露限值。

因此，在行業(yè)發(fā)展的要求下，“階段化TTC”概念也應(yīng)運(yùn)而生［19］。

美國藥物研究和制造商協(xié)會在2006 年開發(fā)了一套基因毒性雜質(zhì)檢測、分類、界定和獨(dú)立風(fēng)險評估的程序。

根據(jù)積累劑量定義暴露風(fēng)險的原則，提出了階段化TTC 概念，見表3 和表4。

有些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基團(tuán)被識別為具有較高的效價，即使攝入量低于TTC 水平，從理論上來說仍可能會導(dǎo)致顯著癌癥風(fēng)險。

基于上述這些原因，應(yīng)進(jìn)行風(fēng)險評估來決定是否需要采取進(jìn)一步行動。

根據(jù)誘變性和致癌性，可將雜質(zhì)分為5 類，見表5 所示［16，18］。

在藥物基因毒性雜質(zhì)的研究中，確定雜質(zhì)的個數(shù)和種類后，需計算其在藥物中的可接受限度，具體計算方法參考表5。

藥物的生產(chǎn)過程中可能會涉及多個基因毒性雜質(zhì)，因此在計算雜質(zhì)限度時，還應(yīng)注意以下2 點(diǎn)原則［20］:

① 多個基因毒性雜質(zhì)存在于原料藥中，只要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)( 指警示結(jié)構(gòu)) 不相關(guān)，1.5 μg·d-1 的TTC 限度可應(yīng)用于單個雜質(zhì)。

② 在原料藥中存在一個以上的基因毒性雜質(zhì)時，1.5 μg·d-1 TTC 值對每一個結(jié)構(gòu)不相關(guān)的雜質(zhì)是適用的。

在結(jié)構(gòu)相似的情況下，基因毒性雜質(zhì)的作用模式可能一致，并具有相同的分子靶向，在這種情況下，建議該類基因毒性雜質(zhì)的總和為1.5 μg·d-1。

雜質(zhì)的限度明確后，就需要確定雜質(zhì)分析的限度測試濃度，包括選擇適宜的分析儀器和樣品處理方法。

確定好分析方法后就需要對方法進(jìn)行優(yōu)化以及方法學(xué)驗證。

基因毒性雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)種類繁多，如何針對特定的基因毒性雜質(zhì)選擇最合適的分析方法是藥物中基因毒性雜質(zhì)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

總結(jié)基因毒性雜質(zhì)分析研究中各種分離方法和檢測器的特點(diǎn)［21］，見表6，為藥物中基因毒性雜質(zhì)分析方法選擇提供參考。

基因毒性雜質(zhì)種類繁多，且在藥物中含量低、結(jié)構(gòu)差異大，故針對不同的待測物選擇不同的樣品前處理方法。

如何提高檢測方法的靈敏度和專屬性，是藥物中基因毒性雜質(zhì)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

基因毒性雜質(zhì)檢測方法聚焦在如下3 個方面:

 ① 選擇先進(jìn)的分析儀器，如GC-MS，LC-MS 等方法: 質(zhì)譜檢測器的高靈敏度適用于微量或痕量物質(zhì)的檢測，而且專屬性好。

② 采用衍生化技術(shù): 衍生化方法增加基因毒性雜質(zhì)的穩(wěn)定性或者生成易檢測的衍生化產(chǎn)物，提高分析檢測的靈敏度。

③ 基質(zhì)鈍化: 采用萃取或SPE 等方法，除去大部分基質(zhì)以減小對待測物的干擾，同時達(dá)到富集待測物的目的，提高分析方法的靈敏度。

根據(jù)相關(guān)法規(guī)和文獻(xiàn)報道，總結(jié)藥物中常見的基因毒性雜質(zhì)的處理方法供參考［18，22-27］，見表7。

一個藥物中可能含有多種基因毒性雜質(zhì)，這就可能需要建立多種檢測方法對其分別進(jìn)行測定，多種檢測方法的結(jié)果相互佐證。

6、基因毒性雜質(zhì)的研究難點(diǎn)和問題

針對基因毒性雜質(zhì)限度低、結(jié)構(gòu)多樣、化學(xué)性質(zhì)活潑等特點(diǎn)，研究面臨諸多難點(diǎn)，主要表現(xiàn)在如下幾個方面。

① 基因毒性雜質(zhì)的種類多，理化性質(zhì)差異大。針對某一個藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測可能需要開發(fā)多個研究方法，各方法的研究結(jié)果相互補(bǔ)充，以滿足測定要求。

② 基因毒性雜質(zhì)的穩(wěn)定性差的問題。基因毒性雜質(zhì)多含有活潑的官能團(tuán)，易和介質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)或自身容易發(fā)生氧化、還原或分解反應(yīng)等，在樣品分析過程中可能需要加入穩(wěn)定劑或者衍生化解決穩(wěn)定性的問題。

③ 基因毒性雜質(zhì)的限度較低。在檢測中通常會配制高濃度的供試品，以達(dá)到設(shè)定的檢測限。

在液質(zhì)方法檢測中，高濃度的供試品可能析出、堵塞色譜柱、污染離子源、基質(zhì)效應(yīng)以及干擾待測物出峰等問題，增加檢測的難度。在實際研究中可以改變?nèi)軇┙M分讓供試品析出或SPE 等其他方法，將高濃度的基質(zhì)除去。

在設(shè)定液質(zhì)條件時，還可以將主成分的色譜峰切出質(zhì)譜。

④ 藥物在降解過程產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)檢測難度大，相關(guān)的報道也少，降解產(chǎn)物基因毒性雜質(zhì)應(yīng)該得到有關(guān)方面的關(guān)注。

⑤ 溶解性問題。一般供試品的濃度高，選擇合適的溶樣液體系，使得潛在的基因毒性雜質(zhì)完全溶解，確保檢出結(jié)果的可靠性; 基因毒性雜理化性質(zhì)差異大，在實驗初期，要選擇合適的溶劑，使得對照品完全溶解，同時溶劑對待測物無干擾。

溶劑還可能影響到待測物的穩(wěn)定性。

⑥ 一些未知物質(zhì)給測定帶來不確定的影響。

某些藥物其光學(xué)異構(gòu)體具有基因毒性，對于制劑里面異構(gòu)體檢測可采用正相色譜，通常要通過富集和衍生化，去除輔料的干擾，提高檢測的靈敏度。

⑦ 基因毒性雜質(zhì)的限度低。一般需要使用液相質(zhì)譜或者氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，質(zhì)譜檢測方法作為藥品的日常檢測對于企業(yè)來說增加了成本。

⑧ 企業(yè)對藥物工藝路線中涉及的基因毒性雜質(zhì)來源評估不全面。

沒有全面考慮起始物料、試劑、溶劑等可能帶入的基因毒性物質(zhì)，對工藝過程中可能產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)也沒有充分評估等。

藥物中基因毒性雜質(zhì)由于限度要求低和化學(xué)性質(zhì)活潑等原因，使得測定方法要有較高的靈敏度，一般將衍生化或SPE等樣品處理方法同液質(zhì)和氣質(zhì)檢測儀器結(jié)合起來。

藥物中基因毒性雜質(zhì)的限度檢查研究關(guān)注藥物中痕量的毒性雜質(zhì)，拓寬了藥物的質(zhì)量控制范圍，為藥物的臨床應(yīng)用安全性提供保障。