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嘉峪檢測網 2020-06-30 11:43
前言
對于藥學領域的方法驗證ICH、藥典委員會、CDE等權威機構都有相應的指導原則，雖然內容各有不同，但總的思路和原則其實是一致的。指導原則寫的是一些很寬泛的指南性的內容，很少涉及具體操作以及為什么要這么做。筆者撰寫本文的目的就是根據自己的經驗和理解，深入剖析每個驗證概念的含義，詳細說明方法驗證應該怎么做，為什么要這么做，以此為新進入藥學研究領域的同仁解決所以然的問題。目標定這么大，而能力又實在有限，不當之處在所難免，敬請方家指正。以下具體操作過程及相應數值，可以作為參考，并不一定適用于所有情況。
一、專屬性
1.概念解析
專屬性系指在其他成分(如雜質、降解產物、輔料等）存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力。
這句話的意思是被測物在其他成分的干擾存在下，依然能得出合理的結果。除去被測物之外，所有其他成分都是干擾源，以含量測定（外標法）為例，被測物是主成分峰，除此之外的供試品溶液中的一切其他成分都是干擾，包括稀釋劑、輔料、有關物質、無機鹽、殘留溶劑等等。研究不可能覆蓋所有的可能性，只需要研究高風險因素，一般來說稀釋劑、輔料和有關物質是專屬性的高風險因素。
2.怎么做？為什么？
1)主成分峰純度
在專屬性驗證的相關實驗中，主成分峰都應該考察峰純度，確認主成分峰為單一成分的峰。具體做法是用DAD檢測器進行峰純度掃描或者用LC-MS確認沒有其他成分。
2)稀釋劑
應考察稀釋劑對被測物的干擾，空白稀釋劑出的峰應不干擾被測物。具體做法是按照質量標準規定的進樣量檢測空白稀釋劑，記錄色譜圖。
3)輔料
取質量標準規定量的供試品中等量的空白輔料，按照規定分析處理，記錄色譜圖，空白輔料峰應不干擾被測物。
4)有關物質
有關物質分為兩大塊：工藝雜質和降解雜質。如果在二者均可獲得的情況下，將雜質分別定位，并配制一份混合溶液，根據檢測內容的不同分別研究。含量測定各雜質峰應不干擾主成分的檢測，即各雜質峰應和主成分峰達成基線分離，各雜質峰之間沒有要求，重疊也無妨，因為含量測定只需確認主成分峰不受干擾即可。有關物質中各雜質峰和主成分峰之間的分離度均應符合要求，一般不小于1.5。特殊情況可將某些雜質合并控制，如互為對映異構體的非對映異構體，它們在反相色譜法中一般都是重疊的峰。
如降解雜質不可獲得，應進行酸堿氧化破壞條件下考察可能的降解雜質的干擾，該實驗一般都做，但不是必須做，如果已經對降解雜質有了充分的研究，就無需做破壞實驗。例如已經有了有效期內長期穩定性的研究結果，確認了穩定性期間的實際降解雜質。因為有些情況下，破壞實驗的結果不是真實可能的降解雜質，這種情況以雙氧水進行氧化破壞最為常見，破壞產物雜亂無章，甚至有可能因為該實驗推翻分析方法。降解實驗室一個很大的內容，所以在下個章節詳細論述，需要注意降解實驗應歸屬在專屬性驗證項下。
二、降解實驗
降解實驗的做法各相關指導原則都沒有提出具體的措施，所以各個實驗室做法各有不同，本文闡述的是個人看法，并力圖證明其合理性。
為盡量避免降解實驗產物與實際可能產生的降解雜質的不一致的可能，降解實驗應為長時間弱條件下進行。本人不建議用強條件如高濃度酸堿和雙氧水并輔助加熱等做法，因為強條件下可能會形成二次降解產物，并出現許多降解產物峰，增加方法驗證的難度，而實際穩定性期間出現的降解雜質可能就一兩個甚至沒有。
降解實驗的目的為了預測穩定性期間的降解雜質，不是為了破壞而破壞。比如有說法應將主成分破壞5%-20%之間，但是一般條件破壞不了，就加強條件，必須在這范圍內。而這是沒有必要的，也是不合理的。以下內容詳細論述我的降解實驗的一般做法，個人見解，僅供參考。
1.破壞條件與操作
配制一份5/10倍濃度的供試品儲備液，分別取5ml置25/50ml量瓶中，分別加入0.1mol/l鹽酸溶液、0.1mol/l氫氧化鈉溶液、0.1%雙氧水溶液(如氧化破壞雜質多而亂，可考慮更弱的條件，如溶液中充氧氣飽和)5ml，室溫放置1天，酸、堿分別加等量堿、酸中和，再分別加稀釋劑稀釋至刻度。
另分別取0.1mol/l鹽酸溶液、0.1mol/l氫氧化鈉溶液、0.1%雙氧水溶液5ml置量瓶中，同法操作，作為各破壞條件下的空白。如為制劑，應同法做空白輔料的破壞實驗。
取上述5/10倍濃度的供試品儲備液5ml置25/50ml量瓶中，加稀釋劑至刻度，作為供試品溶液。
分別取上述溶液，按照質量標準規定進行分析，記錄色譜圖。
注意：酸、堿和雙氧水溶液濃度和放置時間均可以根據破壞情況進行調整，如某個條件有降解傾向，應調節條件使破壞至5%-20%之間。如三者均未發現降解傾向，再放置一段時間如10天，依然如此，既可說明本化合物非常穩定，穩定性期間應不會產生降解雜質。本人有一個項目按此條件做破壞，均未產生破壞產物，長期穩定性試驗2年，有關物質檢測結果和0天分毫不差。
2.數據報告
1)峰純度
各條件下的峰純度應符合要求。
2)分離度
含量測定方法各破壞產物應與主成分達成基線分離，有關物質方法各破壞產物與主成分、現有雜質之間的分離度均應不小于1.5。
3)質量守恒
有關物質檢測方法需要做質量守恒的驗算，應評估主成分減少的量與雜質增加的量的一致性。理論上如主成分減少10%，雜質應增加10%，才能說明有關物質方法能準確檢出所有的降解雜質。如二者不一致，則證明方法有缺陷，或為降解雜質未檢出，或為降解雜質研究不充分，因為沒有獲得主要降解雜質的對照品，不清楚主要降解雜質的校正因子。
4)質量守恒驗算方法
如主成分峰在線性范圍內，可將供試品溶液的主峰峰面積和校正后的總雜質峰面積之和A供除以與破壞后的溶液主峰峰面積和校正后的總雜質峰面積之和A破，其限度應在98%-102%之間。即A供/A破的值應在98%-102%之間。制定此限度的依據是藥典液相系統適用性實驗連續進樣5針，允許RSD不大于2%，也即數據2%以內的誤差可以歸屬為儀器引入。
如主成分不在線性范圍內，則可測定供試品溶液和破壞后的溶液的主成分含量和有關物質，含量減少值除以有關物質增加值，限度應在90%-110%之間。制定這個依據源自校正因子0.9-1.1之間都可不加校正因子計算有關物質，表明雜質結果允許10%的誤差。
以上兩個限度非官方規定，為合理限度，僅供參考，實際工作中可根據情況進行調整，本文中涉及的大部分數字都是如此。
3.補充說明
降解實驗可以有關物質和含量測定同時做，二者可以共用同一份破壞樣品，減少工作量，一般來說有關物質的供試品濃度大于含量測定，可以將有關物質破壞后的溶液稀釋至含量測定規定濃度。具體如何操作請讀者諸君自己設計。
三、準確度
1.概念解析
準確度系指采用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（％ )表示。回收率實驗一般在有關物質、殘留溶劑、制劑含量測定中較為常見，因為需要考察被測物在有其他成分的干擾情況下準確檢測的能力，如有關物質會收到主成分的干擾，制劑含量測定受到輔料干擾等。回收率實驗在原料藥含量測定卻是一種無法操作的尷尬處境。用原料藥對照品標定沒有任何干擾的原料藥對照品自己？下文將闡述準確度驗證的操作方法。
2.含量測定準確度
1)制劑含量測定
一般平行配置三份10倍濃度對照品儲備液，分別取8、10、12ml置于預先加入相應量的空白輔料的100ml量瓶中，稀釋制成80%、100%、120%的供試品濃度的9份溶液，取其中兩份10倍濃度對照品儲備液制成對照品溶液，分別取上述溶液按質量標準進行分析處理，按外標法計算得出上述9份溶液的含量，再除以對照品實際加入量，得出回收率數據，回收率應符合規定。
為什么是驗證80%、100%、120%的供試品濃度溶液，而不是其他？這是因為質量標準中規定的是“取相當……約…….mg”,也就意味著供試品濃度一般在100%±10%范圍內，即使考慮儀器和操作誤差，那么80%-120%的區間一定包括了實際檢測過程中供試品濃度所在的區間，再大的區間沒有必要。含量測定的線性范圍原因同樣如此，溶出度線性范圍和準確度范圍與此不同。
2)原料藥含量測定
一般來說，不具有可操作性，所以我在實際工作中不進行相關驗證。因為指導原則有原文指出“準確度也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來”，也就是說如果精密度、線性和專屬性驗證均符合要求，則準確度必定符合要求，無需驗證。但總有人擔心審評老師找麻煩，硬是要做這個，就推薦兩個我所知的同仁的做法供大家參考。
一是9份準確度溶液中原料藥和原料藥對照品各一半，另外一種做法是用原料藥對照品按外標法計算原料藥對照品的含量，其結果和對照品的標定值做對比。
3.殘留溶劑準確度
以最常用的頂空進樣法為例，配制一份2倍濃度供試品儲備液，取質量標準中1/2體積的儲備液分別置10個頂空瓶中。其中一份加入1/2體積的稀釋劑，作為供試品溶液。配制一份10倍濃度對照品溶液，稀釋制成50%、80%、100%規定濃度的2倍儲備液（該項可以商酌，個人認為溶劑殘留超標即不合格，超過100%準確度可不驗證）1/2體積，分別加入上述剩余9個頂空瓶中，作為準確度檢測溶液。另取10倍濃度對照品溶液，稀釋制成100%規定濃度溶液，作為對照品溶液。依法測定，計算供試品與準確度檢測溶液溶劑殘留值，二者之差除以對照品實際加入值，回收率應符合規定。
4.有關物質準確度
分別配制一份10倍濃度供試品溶液與規定限度雜質對照品混合儲備液，取5ml供試品儲備液置50ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，作為供試品溶液。如為自身對照法，依法配制對照液。取供試品儲備液5ml，分別置9個容量瓶中，分別加入適量雜質對照品混合儲備液制成50%、100%、150%限度各三份的準確度溶液。取上述溶液，依法測定，計算供試品已有雜質含量、加雜準確度溶液雜質含量，二者之差除以雜質對照品實際加入量，即為回收率，應符合規定。
需要注意的是，有關物質準確度的數據應該按照質量標準規定處理，例如質量標準規定為加校正因子的自身對照法，則應該按照質量標準的規定計算各樣品溶液的雜質含量，并計算回收率。舉例如下：在5mg的供試品溶液中加入了5μg的雜質，實際加入量為0.10%，供試品該雜質的本底量為0.01%，加雜后根據加校正因子的自身對照法計算實測值為0.105%，則回收率=（0.105-0.01）/0.10=95%。偶見用外標法計算有關物質的回收率，而質量標準規定的是自身對照法。這背離了方法驗證的本意，方法驗證應該驗證方法自身的準確度。如果用外標法回收率合格，但線性驗證出現問題，校正因子計算不準確，導致實際工作中檢測結果偏離真實值，而方法驗證卻判斷符合要求，這明顯是不合理的。
5.其他
如溶出度、異構體、某些基因毒性雜質等檢測方法的準確度驗證，限于篇幅所限，不再一一列舉，但都可以參照以上做法的思路設計實驗方案。
四、定量限與檢測限
1.定量限
定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度和精密度。從這一概念出發，應確定信噪比為10的供試品的濃度是理所當然的。然而響應情況隨著儀器與流動相的不同而不同，在方法驗證時所選儀器與流動相得出的信噪比為10的供試品的濃度不具有普遍意義上的代表性，這只是一個偶然值。我們在實際工作中其實無需確定信噪比為10的供試品的濃度，只需證明方法需定量的限度的合理性。以下舉例說明：若方法報告限規定為0.05%，那么肯定需要證明此限度能準確定量，如不能準確定量，則此項規定不合理。我們可以稀釋制成0.01%的相應溶液，注入儀器檢測，其信噪比如大于10，則證明方法有合理的定量限。無需費時費力找出每個雜質的信噪比10的濃度，特別是已知雜質數量較多的情況下，工作量將極為巨大。直接稀釋至特定濃度考察信噪比，則非常簡單，只需將線性驗證項下的混合雜質溶液稀釋至目標濃度即可。
還有一種簡單的計算LOQ的方法就是根據線性驗證的結果計算，公式為LOQ=10×STEYX/斜率，STEYX為線性數據的剩余標準偏差，可以用EXCEL直接算出這個值。
LOQ濃度樣品應連續進樣6次，考察響應的精密度。
2.檢測限
可將上文舉例的0.01%溶液稀釋2-5倍直接考察信噪比，大于3即可。也可由公式LOD=3.3×STEYX/斜率計算得出檢測項濃度。
五、線性與范圍
該項驗證各指導原則已經有較為詳細的說明，故沒有太多論述的必要。我在此僅說明一下進行此項需要注意的地方。在有關物質線性驗證中，除面積歸一法之外，范圍不宜太寬，否則相關系數較差，截距較大。如果波長較小，接近流動相截止波長，則流動相本底吸收較大，則更要縮小線性驗證的范圍。每個點峰面積為供試品實際響應值減去流動相本底值。日常工作中細心的同志應該能發現在高流動相本底吸收的低濃度下響應遠小于高濃度響應除以相應稀釋倍數的值，就是由于流動相本底的影響。一般有關物質線性范圍可以是限度的20%、50%、80%、100%、120%、150%。還需注意的是線性范圍應包括準確度的三個值。
六、耐用性
耐用性系指測定條件發生小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。此概念看定義就能清楚理解，沒有敘述的必要。故只提供一下本人在實際工作中的做法。一般來說耐用性每種條件變動，都應該考察系統適用性，證明系統適用性不受影響，如有關物質考察是否符合質量標準規定的分離度要求，含量測定考察進樣精密度、拖尾因子等。我們可以與精密度驗證同時進行，取精密度驗證中其中一個樣品為預定色譜條件，其他變動條件下測定該樣品的結果與該樣品在精密度項下的結果匯總統計分析。以含量測定為例，舉例如下：
如某個條件變化系統適用性或檢測結果不符合要求，則應研究更小的變化區間以使相關驗證符合要求。如變化區間過小，則方法耐用性不佳，以后方法在不同實驗室轉移或者不同人員操作結果的重現性將存在巨大風險。
另外需要說明的是溶液穩定性也歸屬于耐用性驗證項下，并非獨立的驗證項。時間的變化也屬于條件的微小變化之一。一般取樣時間點為2、4、8、12、16、24、36、48h，如果4小時后即不穩定，應在質量標準中規定臨用新配。
耐用性為分析方法的挑戰性驗證，一個好的方法應能在合理的盡可能大的區間內符合驗證要求，以便于今后工作的開展。如溶液有良好的穩定性，供試品溶液放置數天后仍然可以用來檢測；柱溫的要求很隨意，即使柱溫箱損壞也不影響檢測的進行等等。
七、精密度
該項驗證沒有歧義較為簡單，我也僅提出一些本人的看法。值得一提與討論的是有關物質的精密度驗證。如采用中試樣品做重復性驗證，測出某個雜質的6個值分別為：0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.02%，該方法的重復性好不好？在實際工作中這樣的數據其實沒有任何問題，并不影響對結果的判斷，因為這可能只是0.014%和0.015%的差別，但由于2015年版中國藥典四部在其指導原則中對有關物質精密度驗證的RSD提出了近乎天方夜譚的要求，它要求必須計算RSD還必須滿足它的要求。那么上述數據就完全不可能滿足相應的限度要求。對于這種用強權強奸真理不顧客觀事實一刀切的做法，我也只能無視了。RSD考察有關物質的精密度在上述數據中會顯出一個非常高的數據，但是這其實并沒有什么意義。有關物質檢測結果的統計分析還可以用極差的方式，如認為實際工作中報告的結果±0.01%都可以接受，那么單雜的極差不大于0.02%，即可說明方法具有良好的精密度。
可能有些同仁還是不放心，因為審評老師可能不會那么講道理，那我就推薦一種做法，即在供試品中加入限度規定量的雜質對照品，這樣的話RSD將小很多。具體做法如下：分別配制一份10倍濃度供試品儲備液與10倍濃度雜質儲備液，各取2ml置同一20ml量瓶中，平行配制6份，以此作為精密度驗證用樣品。
八、后述
方法驗證的題目取的有點大，寫了很多，但發現還是有很多問題淺嘗即止，未能深入闡述。再次重申，以上所有具體操作與限度值未必適用于所有情況，可以作為進行調整的參考，且為個人看法，非客觀真理，能力所限，錯誤之處在所難免，歡迎撰文駁斥。
來源：占小兵/藥事縱橫
