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有關(guān)物質(zhì)系藥品中除主成分以外的雜質(zhì)，它可能是原料藥合成過程中帶入的原料、中間體、試劑、分解物、副產(chǎn)物、聚合體、異構(gòu)體，以及不同晶體、旋光異構(gòu)的物質(zhì)，也可能是制劑生產(chǎn)過程或在貯藏、運輸、使用過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物等。由于有關(guān)物質(zhì)的含量較少，所以選擇專屬性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好的檢測方法至關(guān)重要。目前常用的方法有HPLC法和TLC法，后法已有討論。本研究主要闡述HPLC法的建立過程。

HPLC法檢測有關(guān)物質(zhì)的方法有：

(1)雜質(zhì)對照品法(適用于已知雜質(zhì))；

(2)主成分自身稀釋對照法(適用于一般雜質(zhì)檢查，雜質(zhì)成分少且尚不能取得其對照品，簡稱“自身對照法”)；

(3)歸一化法(現(xiàn)已不多用)。

前法為外標(biāo)法、定量檢測；后兩法均為限量檢測。自身對照法又可分為加校正因子計算和不加校正因子計算。目前，國內(nèi)多采用后法。

1、色譜條件的確定

專屬性是色譜條件建立的關(guān)鍵，通常是采用在被測物對照品(或供試品)中加入適量的雜質(zhì)或輔料，以驗證所選色譜條件能否將各雜質(zhì)與被測物分離檢出。應(yīng)按1％(w/w)被測物濃度的各雜質(zhì)量添加至被測物中，模擬被測物中可能存在雜質(zhì)的狀態(tài)，即有少量(約1％)雜質(zhì)存在時能否與被測物達到完全分離(分離度大于1.5)，以驗證系統(tǒng)適用性。

只有這樣才能較為客觀、科學(xué)地反映被測物的實際情況。而不應(yīng)將被測物與各雜質(zhì)配制成相同濃度的溶液，因為實際檢測中不可能存在這種情況，且該濃度也不易確定。在實際檢測時，由于被測物濃度較大，很易將相鄰雜質(zhì)峰包含其中。

另外還需測定溶劑和輔料(檢測制劑時)是否有干擾。目前，美國藥典(USP)、英國藥典(BP)及許多進口產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，有關(guān)物質(zhì)測定方法學(xué)的專屬性驗證均采用此法。還須說明的是：雜質(zhì)與雜質(zhì)峰間的分離度達1.2即可，而被測物與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度必須大于1.5。

有關(guān)物質(zhì)檢測的研究對象是雜質(zhì)，而非被測物。但測定則是通過各自的峰面積來表達，故波長的選擇必須考慮被測物和各雜質(zhì)在檢測波長下的校正因子(f)是否相同。應(yīng)分別制備相同濃度的被測物與各雜質(zhì)溶液，經(jīng)紫外掃描后以吸光度相近的波長為檢測波長。

在該檢測波長下，分別進樣測定，由各峰面積計算校正因子。若f為0.8～1.2，則表明被測物與各雜質(zhì)的f相同，可消除f的影響。若f≤0.8或f ≥1.2，則應(yīng)在計算時加入f。目前通常以被測物的最大吸收波長為檢測波長、不加校正因子的計算方法，而未綜合考慮各雜質(zhì)的f。

供試品溶液濃度的確定也非常重要。雖然濃度越高越能反映被測物中雜質(zhì)存在的情況，但若設(shè)定過高，會產(chǎn)生主峰嚴(yán)重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載等情況；若設(shè)定過低，則靈敏度不夠，無法檢測雜質(zhì)及其含量變化。

最低檢出濃度的測定可分為信噪比法和直接評價法兩種。后法是目前較為科學(xué)的做法，即將儀器的靈敏度調(diào)至較適宜的值(僅對靈敏度可調(diào)節(jié)的儀器而言，目前市場上主流品牌的液相色譜儀均已設(shè)定了一個恒定、較為靈敏的值)，然后將被測物溶液不斷稀釋后進樣測定，直至被測物峰面積無法檢出為止，此時的濃度即為最低檢出濃度。

最大進樣量則是采用不斷增加被測物溶液濃度，直至峰嚴(yán)重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載等情況出現(xiàn)。

根據(jù)最低檢出濃度，采用“上推法”來確定供試品溶液濃度：如一般設(shè)定雜質(zhì)總量小于1.0％對照液，對照溶液的濃度至少應(yīng)為最低檢出濃度的20～50倍，供試品溶液濃度則應(yīng)是最低檢出濃度的2000～5000倍。

同時還應(yīng)考慮儀器、色譜柱等因素對最低檢出濃度和最大進樣濃度的影響(即耐用性因素)，所以供試品溶液的濃度應(yīng)在保證小于最大進樣量的情況下，適當(dāng)設(shè)定得高些，以保證該濃度在任何試驗條件下，均有足夠的檢測靈敏度。

表1為最低檢出濃度、最大進樣量、供試品溶液和對照溶液間的比例關(guān)系(進樣量10μl，規(guī)定雜質(zhì)限度1.0％)。

在穩(wěn)定性考察中，如某雜質(zhì)含量不斷增加，則說明被測物降解的途徑穩(wěn)定、可循，則有必要對該雜質(zhì)進行針對性地監(jiān)控，即采用該雜質(zhì)對照品(經(jīng)確證結(jié)構(gòu)后，由人工合成獲得)以外標(biāo)法準(zhǔn)確測定。此時，與含量測定相似，應(yīng)進行線性試驗。

通常將雜質(zhì)限度設(shè)定為該雜質(zhì)的100％濃度，線性驗證范圍10％～150％(即相當(dāng)于被測物測定濃度的1.5％～0.1％)。且精密度試驗也應(yīng)符合要求，但RSD可根據(jù)實際情況，適當(dāng)放寬至3.0％～5.0％。

回收率試驗采用在已知雜質(zhì)含量的被測物中加入定量雜質(zhì)的方法來評價。將各雜質(zhì)以1％(w/w)的濃度加至被測物溶液中，以驗證所采用的色譜條件是否可分離檢測相應(yīng)的各雜質(zhì)以及與被測物中已存在的雜質(zhì)是否累加，并觀測累加量的準(zhǔn)確性。

流速的選擇：主峰保留時間應(yīng)在10min以后，這樣主峰不易出現(xiàn)拖尾、堆積的現(xiàn)象。

柱溫的選擇：不應(yīng)超過35℃，既可增強被測物與雜質(zhì)的分離度，也可避免因溫度過高使主峰降解，導(dǎo)致測定誤差。

溶劑的選擇：由于有關(guān)物質(zhì)測定的供試品溶液濃度高，應(yīng)首先考慮被測物在溶劑中的穩(wěn)定性一般選流動相作溶劑為宜，以排除溶劑峰的干擾。但由于有關(guān)物質(zhì)的測定必須扣除溶劑峰，因此只要溶劑峰不干擾被測物質(zhì)峰，即使不選用流動相作溶劑，也完全可以。

一些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂時片面追求采用流動相作溶劑，有可能未將被測物全部溶解(由于有關(guān)物質(zhì)測定多選用自身對照法，故未能發(fā)現(xiàn))。在流動相溶解性不佳時，可采用甲醇或乙腈作溶劑以提高溶解性。

色譜圖記錄時間的設(shè)定：應(yīng)能洗脫出有可能存在的全部雜質(zhì)和經(jīng)強力破壞試驗產(chǎn)生的雜質(zhì)，并規(guī)定至主成分保留時間的幾倍為止。在測定制劑的有關(guān)物質(zhì)時，個別輔料出峰滯后，此時應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中注明。

如鹽酸貝那普利片的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[YBH13652004]中，有關(guān)物質(zhì)測定項下規(guī)定：記錄供試品溶液色譜圖至主成分峰保留時間的10倍，供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和(扣除溶劑峰、溶劑峰前的輔料峰及主峰保留時間7倍后的輔料峰)。

積分參數(shù)的設(shè)定：色譜峰峰面積的大小主要由斜率和峰寬兩個積分參數(shù)決定。斜率越大，切線的傾斜角越大，峰面積越小；而峰寬一般無規(guī)律可循。此外還有一個非常重要的參數(shù)是最小峰面積。

該參數(shù)設(shè)定得越大，雜質(zhì)峰越不容易被積分檢出，被測物雜質(zhì)含量就易合格。關(guān)于最小峰面積的設(shè)定，目前國內(nèi)還沒有一個定論，因此經(jīng)常會在一些雜質(zhì)總量稍多、雜質(zhì)含量處于邊緣時，產(chǎn)生檢驗結(jié)論的分歧。

建議借鑒英國藥典(BP)的做法，即在所有采用HPLC法檢測有關(guān)物質(zhì)的品種項下，均規(guī)定舍棄對照溶液主峰面積1/20以下的峰。也就是說0.05％以下的雜質(zhì)峰可被認為與噪音相當(dāng)、無必要積分。中國藥典2000年版二部中僅有頭孢克洛、頭孢呋辛鈉和硝苯地平3個品種項下有此規(guī)定；而2005年版二部中已增至25個品種，但均為抗生素品種。