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嘉峪檢測網 2020-08-17 17:13
【導讀】藥物中的雜質是否能被全面準確地控制，直接關系到藥品的質量可控與安全性。《中國藥典》多采用主成分自身對照法規定有關物質的限度，而國外藥典中多用到雜質對照品進行檢測，這也就要求雜質對照品符合一定的質量標準后方可使用。對照品的標定中常涉及的項目包括純度測定、結構確證、含量測定等，考慮到雜質對照品的微量性，標定時選擇合適的分析方法十分重要，如進行純度測定可使用高效液相色譜法、差示掃描量熱法等試樣用量少的分析儀器。
一 概述
藥物雜質的控制是藥品質量控制的關鍵，因為藥品中的雜質可能降低藥物的療效，甚至對人體健康產生危害。因此，對來源于原材料、藥品貯藏與運輸過程中產生的雜質，要進行科學、嚴謹的分析與研究，特別注意對臨床有毒理作用的雜質進行控制，如對可能引起基因毒性雜質的量必須控制到1×10−6水平。
在雜質研究中，使用雜質對照品進行檢測是科學有效的方法。雜質對照品除具有一般對照品的特點外，還具有自身特點：制備困難，樣品量少且價格昂貴。如歐洲藥典委員會提供的雜質對照品的量一般在10 mg 左右或更少。所以標定雜質對照品時，要選擇專屬性強、靈敏度高、進樣量需求少的檢測方法，如高效液相色譜法、毛細管電泳法、核磁共振法等。本文對雜質對照品及其來源進行介紹，并簡要總結了雜質對照品的標定項目和標定方法，希望對雜質對照品的研究工作提供幫助，進而推動藥品質量標準的建立。
二 雜質對照品簡介
雜質對照品屬于對照品的一種。《中國藥典中沒有專門提到雜質對照品，但對對照品有明確定義：“對照品系指用于鑒別、檢查、含量測定的標準物質”。化學對照品（包括雜質對照品）還可稱為化學標準物質、化學對照物質
。《美國藥典》34 版中將化學對照品定義為用于相應原料藥或制劑的鑒別、檢測以及性能驗證試驗的標準物質，當對照品未給出量值時，其量按100.0%
計。《歐洲藥典》與《英國藥典》中也僅提到化學對照品。《歐洲藥典》化學對照品即滿足藥典各論或附錄中規定用途的物質或混合物，除以國際單位定值的標準物質外，藥典化學對照品是基準標準物質。《英國藥典》中除少量使用本國的標準物質外，主要使用《歐洲藥典》的標準物質（包括化學對照品）。
雜質對照品的來源途徑包括制備液相富集及定向合成兩種。世界衛生組織規定用于已知雜質測定的雜質對照品，其純度應不低于95%；如果雜質對照品的純度低于 95%時，要注明其純度。如定向合成利洛司酮中兩個微量雜質單去甲基利洛司酮、氫化利洛司酮，經多次柱色譜分離，含量均可達到97%。當某個雜質對照品的量不能滿足標準物質制備需要時，可以有其他幾種替代方法：（1）將雜質（單個或多個雜質）和其他化合物（一般是主成分或中間體）混合；（2）將多個已知雜質混合；（3）改變分裝方式，由以往常規的用戶精密稱取，定量稀釋使用改為定量分裝后用戶定量稀釋、直接使用。
三 雜質對照品的標定項目
參照對照品的標定項目，雜質對照品的標定項目一般包括：采用有效方法確定其純度，并用其他方法進行驗證；確定水分含量，包括表面水和結晶水；確定殘留溶劑；確定無機雜質總量；確定有關物質。首批雜質對照品還須做相應的化學、理化鑒定試驗，如質譜、核磁共振譜等。
標定方法的選擇直接關系到測定結果的專屬性與準確性，標定時應重點關注檢測方法的選擇與驗證等方面。
1 純度測定
常用方法有高效液相色譜（HPLC）法、薄層色譜（TLC）法等。使用HPLC 法進行測定，需用 3 種不同流動相或檢測波長，應盡可能做到主峰為平頭峰，扣除溶劑峰后，以歸一法計算含量。使用 TLC法時，同樣需使用3 種不同展開劑對雜質對照品進行鑒別，并且至少在一種條件下的斑點足夠大到稍有拖尾，如果 3 次都只得到一個斑點，說明其基本為純物質。
2 結構確證
雜質對照品需要進行鑒別分析，可采用紅外分光光度（IR）法、核磁共振（NMR）法、質譜（必要時采用高分辨質譜）法、差示掃描量熱（DSC）法等確證雜質的化學結構，X粉末衍射（XRD）法可用于測定手性構型。
多種結構檢測方法的聯用也是很好的選擇。采用收集餾分的方法，收集到愈創木酚甘油醚中的微量雜質，再使用液–質聯用法確定了雜質相對分子質量，試驗結果與實驗室標樣結果一致。在研究微量雜質時還可使用大氣壓化學電離飛行時間質譜儀，此法對分子中含極性基團但整個分子無較大極性的化合物響應較強，如甾體類藥物氫化可的松；而電噴霧離子化的方式對極性大的物質響應效果較好。
3 含量測定
要求用兩種方法測定含量，一般為容量法和色譜法。容量法要求兩人分別測定3～5份，每人的平行實驗結果以及兩人的實驗結果的相對偏差均應小于0.3%。色譜法如 HPLC 法需用 3 種濃度作校正因子，精密度要求小于1.5%，一般用面積歸一法計算含量。
氣相色譜（GC）法用于定量微量樣品時，對色譜柱的篩選也很重要，如檢測丙烯腈中可能存在的微量有機物丙烯醛、乙腈、丙酮、唑、丙腈時，比對填充柱與毛細管柱的區別，結果毛細管柱可檢測到含量低于1×10−6的組分，比填充柱的精確度要高。
此外NMR 法也可用于樣品的定量。Jenny等[20]在研究泊洛沙姆中的醛類雜質時使用NMR 法進行定量，試驗結果靈敏、準確，證明此法可在微量樣品定量中進行應用。NMR法特別適用于對新物質的含量確定，測定時無需專用的樣品基準物質，而僅以含量已知的普通化學物質為參比。確定好溶劑和內標，選擇合適的定量峰用于計算，就可測得樣品的絕對含量，方法專屬、快速、簡便。但應注意使用此方法的前提是圖譜不能過于復雜而難以解析，各吸收峰歸屬清楚，用于定量的共振峰應無其他峰影響其積分值的測定。
4 水分測定
雜質對照品可用庫侖滴定法或干燥失重法測定水分。另外必須指出，《中國藥典》通常在干燥失重測定時規定了干燥至恒重，而由于雜質對照品量少，使用干燥失重法測定水分時標準可適當放寬，由對照品的研制者通過實驗探索，確定干燥至恒重的最短的具體時間，并在對照品說明書中注明即可。
5 重金屬測定
微量重金屬元素可采用原子吸收分光光度（AAS）法、原子熒光（AFS）法、電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP-MS）法測定。
6 溶劑殘留測定
樣品中的有機溶劑殘留量一般使用 GC 法檢測，但所配制的供試品溶液的濃度應滿足定量測定的需要，一般供試品取樣量在 0.1～1 g，當樣品量較少且主成分對熱穩定時可考慮做干燥失重，對可能由少量水分帶來的誤差再輔助庫侖滴定法確定水分的量。
四、純度測定方法
純度測定的方法按照用途可分為 3 類：（1）需用外標對照品的方法（如色譜法）；（2）依據固有的動力學特性建立的方法（相溶解度法或差熱掃描法），適用于首批對照品的標定；（3）其他方法。
用第一類方法測定純度時必須用系統適用性試驗進行驗證，色譜法常用于雜質的鑒別及定量。其中 HPLC 法是應用最廣泛的色譜方法，此外TLC法、GC 法、毛細管電泳（CE）法也得到越來越多的應用。第二類方法可用來測定總雜質的含量。如 DSC 法正越來越多的用于檢測具有多晶型結構且構型不同的化合物，同時測定全部固體雜質的總量。第三類方法包括紫外分光光度（UV）法、IR法、NMR 法、滴定法、比旋法等。通過熔程也可判斷純度（樣品量在 1 mg 以上），純化合物熔程很短1～2 ℃；混合物熔點下降，熔程變長。
1 HPLC 法
一般使用二極管陣列檢測峰純度，它可提供痕量水平測定所需的靈敏度。如使用 HPLC法對強心藥氨力農對照品的純度進行測定，檢測量為 0.5 mg，最小檢出 0.049 μg，達到檢測量的 0.01%，試驗中更換色譜柱作為方法耐用性考察，用不加校正因子的自身對照法計算雜質純度，進而得到氨力農的純度，說明 HPLC 法適合氨力農對照品純度的檢測，具有靈敏度高、快速、準確等優點。此法的缺點在于可能會出現雜質漏檢，所以在使用 HPLC法時應充分重視梯度洗脫及波長選擇。
2 TLC 法
TLC 法屬于半定量方法，所用儀器簡單且價格較低。試驗時要求 3 個展開系統，顯色靈敏度要達到檢測量的 0.1%～0.2%。此項技術易于操作并且可方便地在微克水平進行試驗。該方法可分離立體異構體或者同系物等結構相似的有關物質。但TLC 法影響因素較多，檢驗對照品時需有所注意，建議作為輔助測定方法。
3 DSC 法
DSC 法是一種簡便、快速、可靠且試樣用量少的方法，尤其適合雜質對照品純度的測定，如用改良過的熱分析法對病毒唑的已知雜質進行定性分析，結果雜質的檢測限可以到 0.04 mg。《美國藥典》從 16 版開始至今一直將 DSC 法用于對照品的純度檢查，目前各國藥典均已收載。如用 DSC 法和熱失重法對雌二醇化學對照品的純度進行了測定，得到兩個吸熱峰，經計算熱失重為 3.3%，顯示分子中含有半分子結晶水并進一步通過計算得出雌二醇對照品純度。
4 軟電離質譜法
軟電離質譜的特點是只給出化合物的準分子離子峰。如果樣品不純，就會檢出多個準分子離子峰，不但確定了純度，還能明確混雜物的相對分子質量。
5 NMR 法
在氫譜中如果發現有很多面積積分值不到 1 的小峰，就有可能是樣品中的雜質。利用門控去偶的技術通過對碳譜的定量也能實現純度鑒定。此外還可以將上述多種純度測定方法相結合對結果進行驗證。如采用測定熔點、TLC 法和 HPLC 法對阿苯達唑亞砜鹽酸鹽進行了純度測定。使用 HPLC 法時用面積歸一法計算雜質含量，3 種方法均驗證阿苯達唑亞砜鹽酸鹽可作為對照品使用。
五、總結
對于組份單一、純度較高的藥物，對照品(標準品)標定方法宜可進行等當量換算、精密度高、操作簡便快速的容量法。可根據藥物分子中所具有的官能團及其化學性質，選用不同的容量分析方法，但應符合如下條件：(1)反應按一個方向進行完全;(2)反應迅速，必要時可通過加熱或加入催化劑等方法提高反應速度;(3)共存物不得干擾主藥反應，或能用適當方法消除;(4)確定等當點的方法要簡單、靈敏;(5)標化滴定液所用基準物質易得，并符合純度高、組成恒定且與化學式符合、性質穩定(標定時不發生副反應)等要求。
如該藥物沒有可進行等當量換算并符合要求的容量法時，可采用反復純化的原料，色譜法確定純度后扣除有關物質、熾灼殘渣、水分和揮發溶劑等后的理論含量確定為標準品含量，以此為基準進行對照品(標準品)的換代和量值傳遞。
用于抗生素微生物檢定法的代基準標準品可參照上述方法標定，如為多組份抗生素，其組份比例應與擬上市產品組份比例一致或接近，或以其中某一組份純品為基準標準品，但要注意標準品換代時量值傳遞的恒定。
僅用于鑒別定性的化學對照品，注重其結構確證的研究資料，純度和含量的要求一般可適當降低。
雜質對照品，用作限度要求時，應提供其來源(合成路線)、結構確證的研究資料，應具備較高的純度和含量，并提供純度和含量的的測定結果，提供質量控制標準。
來源：北京藥研匯
