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嘉峪檢測網 2021-08-05 13:47
摘要：
QC試驗過程較為繁瑣，涉及環節、實驗用具及人工操作較多，污染事件發生率普遍偏高。尤其近年來為提升檢驗方法的靈敏度和便捷性，采用HPLC檢測的項目越來越多，液相小瓶在試驗過程中不可或缺，其生產廠家較多、價格偏貴，實驗室為節約成本可能會采購成本低的，加之瓶口較小，不易有效清洗，實驗室因此發生的污染事件較多，您的實驗室發生過此類事件嗎？您在調查中都做了哪些？老王給大家分享一個由液相小瓶引發的謎案，希望能給大家帶來些許啟示。
一、案例描述：
進行某口服固體制劑有關物質方法驗證（精密度）時發現：6份100%的加標供試品（供試品+待測雜質）中雜質A的回收率相差較大，有的回收率低于80%，不符合驗證要求（要求80%-120%），有的回收率符合要求，大約98%左右。
二、偵破過程：
調查1 ：仔細對比找規律
因對照品溶液與加標供試品溶液中加入的雜質A為同一份貯備液，做驗證的人員也是崗位的操作能手，出現操作失誤的可能較小，這樣的情況挺異常的。仔細查看和對比色譜圖發現：回收率不符合要求的加標供試品溶液色譜圖中，雜質A峰面積比回收率符合要求的100%的加標供試品溶液、以及雜質A對照品溶液的峰面積明顯偏低，同時多了一個未知峰（保留時間約15分鐘），峰面積與色譜圖見表1、圖1、圖2（僅引用一組數據和色譜圖）。
表1
圖1：對照品溶液色譜圖（雜質A對照品+主成分對照品）
圖2：加標供試品溶液色譜圖（供試品溶液+雜質A對照品）
老王提示：一定要關注色譜圖中的異常峰（仔細對比、有效識別），能夠為異常調查提供方向。
調查2：擴大范圍追蹤跡
由于對照品溶液中雜質A與加標供試品溶液中的雜質A使用同一份貯備液，同時又發現了未知峰（保留時間約15分鐘），老套路，繼續對比和分析所有的色譜圖。當然，收獲很大，又有了新發現：部分對照品溶液色譜圖中也偶有該未知峰（保留時間約15分鐘）出現，其他加標供試品溶液色譜圖中該未知峰的大小不一，毫無規律。同時發現只要色譜圖中出現了保留時間約為15分鐘的未知峰，雜質A的峰面積就會減小，并且雜質A峰面積和未知峰面積相加后與雜質A對照品的峰面積接近，（如上圖中，加標供試品溶液中雜質A峰面積68.42與未知峰峰面積24.92相加后等于93.34，與雜質A對照品的峰面積90.15接近）初步推斷回收率偏低的原因可能是雜質A降解導致。
結合雜質A的性質，其在光照、高溫條件下容易降解，驗證人員回顧整個試驗過程：該試驗在嚴格的避光狀態下進行，同時制備的溶液中有的雜質A正常，有的雜質A降低，所以排除避光不嚴格導致降解的可能；試驗過程中也無高溫因素，因此考慮是否為檢驗過程中的污染導致雜質A降解。
老王提示：發現異常的端倪，一定要擴大范圍查找更多有價值的信息。
調查3：誰污染了我的雜質？
試驗過程中使用的器具有容量瓶、移液管、一次性注射器、液相小瓶等，一次性注射液器是新的，驗證人員反饋本次驗證采用的液相小瓶也是新的。初步調查直接考慮清洗容量瓶和移液管用到的乙醇、鉻酸洗液、洗衣粉進行相應的假設試驗，結果令老王驚喜萬分，你們可以猜猜這次老王的老花眼中有沒有冒出金光？假設試驗結果見表2。
在調查3中僅進了一針模擬乙醇殘留的，雜質A峰面積減小，未知峰出現，是找見了原因還是偶然事件？未確定真正原因，我們將對照品+乙醇的溶液在其他儀器上重復檢驗，同時又重新制備一份對照品+乙醇進行再次假設試驗，均未出現保留時間約15分鐘的未知峰。結果不能重現？為什么？是否為加入乙醇的量不同一造成？還是乙醇并不是“肇事者”？不得而知……有小伙伴理解老王“一個腦殼兩個大”的感受嗎？
調查4：柳暗花明之后又現山重水復，再次推翻初步調查結果
老王提示：有時眼見未必為實，調查中不能僅以一次結果定結論（可能存在偶然性）
調查5 ：為什么結果不能重現？
調查4中結果不能重現，怎么辦？老王的風格之前已經曝光了，遇到問題喜歡追根究底。那么大家都應該猜到了吧，繼續調查！是否為儀器和色譜柱導致？于是我們采用2臺HPLC，用同一份溶液灌注在不同的新的液相小瓶中分別在2臺不同的HPLC上同步檢測，看是否可以重現初次調查結果？
調查5中，同樣的溶液灌注在不同液相小瓶中，用不同的HPLC檢測結果不同，是否為儀器和色譜柱導致？于是再次更換了色譜柱和儀器，采用3號HPLC號儀器和色譜柱將1號HPLC、2號HPLC上的原液相小瓶中的溶液重新檢驗。結果分別與1號HPLC、2號HPLC的初始雜質A、未知峰的峰面積等均一致（原本有的仍有，原本無的仍無），這樣直接就排除了儀器和色譜柱的原因。那么真正的“元兇”到底是誰呢？
調查6： 為什么同一份溶液在不同儀器上結果會不同呢？
調查7：真正的“元兇”是誰？烏云即散明月現
“拍拍身上的灰塵，振作疲憊的精神，問題根源也許難查找，還是要追根究底徹底調查……”哼唱著改編的“壯志在我胸”繼續調查（這首歌估計又把老王的年齡曝光了，知道這首歌的人芳齡都在40+吧）。之前的調查中排除了儀器、色譜柱、容量瓶清洗等原因，假設試驗中采用對照品溶液進行，檢驗人員認為其較干凈，所以在溶液制備完成到灌注液相小瓶時均未使用注射器和過濾頭，直接將容量瓶內的溶液灌注到新的液相小瓶內。那么可以排除過濾的原因，可疑的環節只剩液相小瓶了。在初始調查和每次的假設試驗中，檢驗人員均告知采用新的液相小瓶，所以未考慮其污染的可能性，經過調查和排除，可疑的環節只剩余液相小瓶了，現在該好好審審液相小瓶了！“把近期使用的液相小瓶、瓶蓋和墊片給我押上來……”，看到檢驗人員拿來的液相小瓶，老王老花眼中的金光再次冒出來了，拿來的是棕色的液相小瓶，顏色較之前經常用的兩個品牌的淺，棕色偏黃的感覺，用文字不好形容（品牌不能曝光，否則廠家可能會追殺老王吧），查看了該批次液相小瓶的接收和領用記錄發現：出現異常峰所使用的液相小瓶為XXXX.07.10開始使用（做雜質A驗證期間領用），顏色明顯淺于之前未出現異常峰的液相小瓶。于是緊急從其他實驗室借來其他兩個常用品牌的液相小瓶再次進行了假設試驗（品牌也不能曝光，怕大家以為老王是賣液相小瓶的）。
本次試驗采用3個不同生產廠家的新液相小瓶進行（使用時不進行涮洗），分別為：老品牌的液相小瓶1、老品牌的液相小瓶2、XXXX.07.10新使用的液相小瓶，將同一份加標供試品溶液分別灌注在3種不同廠家的小瓶中（各灌注3份），假設試驗結果見表4。
三、導致該偏差的根本原因：
老王提示：實驗室調查猶如偵破懸案一樣，調查人員猶如偵探+警察，除了需要具備深厚的理論知識，邏輯思維能力還要有豐富的經驗以及匯總分析能力，以及打破沙鍋問到底的精神，才能找出根本原因，制定糾正預防錯誤避免相同的事件重復發生；更少不了合理的假設試驗來支持調查，分析人員也不用怕調查過程復雜，不用怕假設試驗會增加自己工作量。做這些工作利于找出根本原因，也利于預防和避免后續發生相同的事件，減少無效重復工作。
1. 液相小瓶引入的污染
2. 人員使用新購液相小瓶前未進行有效清洗（因客服或工程師告知檢驗人員，小瓶經過高溫煅燒，新瓶使用前可不用清洗直接使用）
四、糾正和預防措施：
1. 封存該批次液相小瓶不再使用，與廠家溝通退貨事宜
2. 繼續采購經常使用的老品牌液相小瓶
3. 文件中規定對于新液相小瓶使用前需要清洗或用待測溶液涮洗以及詳細的清洗方法
4. 對所有檢驗人員進行培訓
五、液相小瓶（瓶體、瓶蓋、墊片）使用與清洗提示：
1. 液相小瓶，瓶蓋、墊片，使用新的不代表是絕對干凈的（新的≠干凈），使用前一定要進行清洗或涮洗（可以用干凈溶劑或待測溶液涮洗3遍以上，可以是5遍、7遍甚至更多）
2. 關于液相小瓶的有效清洗：洗液相小瓶容易，但洗得很干凈卻很難。不是不認真洗，是因為方法不正確，因液相小瓶瓶口較小，溶液不容易進出。在清洗的任何一個環節中，都需要注意要將溶液/清洗劑灌進小瓶內，經過震蕩或超聲后還要將其用力甩出來，記得用力甩甩甩，最后還要烘干干！
3. 關于液相小瓶重復利用的問題：為防止污染和交叉污染，豪橫的實驗室都一次性使用；考慮到企業和實驗室成本也可以有效清洗后重復利用，建議最好專產品專用。
4. 關于液相小瓶采購：液相小瓶價格較為昂貴，實驗室為節約成本，可能會通過比價等采購成本較低的液相小瓶的行為，建議作出決定前考慮風險獲益比，因為發生偏差或出現異常的調查成本其實更高，耗費人力、時間、檢驗耗材、儀器、對照品以及增加實驗室管理成本。
六、結語：
OOS/偏差調查只有原則，無固定套路，要結合具體情況量身定制，并且隨時都可能要作補充調查及相應的假設試驗。老王再給大家分享一個“液相小瓶清洗之歌”
試驗污染真不少、異常發生真煩惱
調查猶如搞偵破、不查原因幕不落
稱溶移定過灌檢、逐個步驟查風險
容量器具易污染、液相小瓶首當先
身小口細不易清、污垢容易藏其中
先用清水猛沖洗，甩干再用洗滌劑
浸泡震蕩效果妙、超聲清洗少不了
最后純水使勁涮、用力甩甩烘干干
來源：藥事縱橫
