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藥物的質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定是藥物研發(fā)過程的重要研究內(nèi)容之一，貫穿于研發(fā)的整個(gè)生命周期。在藥物質(zhì)量研究工作中，分析方法學(xué)的開發(fā)及驗(yàn)證是其重要的組成部分之一。分析方法開發(fā)驗(yàn)證的目的是判斷所采用的分析研究方法是否科學(xué)、合理，能否有效控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量特性，做到質(zhì)量可控。本文旨在和大家一起交流溶出度方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容的一般研究思路，如有存在表述不當(dāng)之處還請各位批評指正。

溶出度方法學(xué)驗(yàn)證的步驟主要有：1）初步確定分析方法，UV法或HPLC法；2）制定驗(yàn)證的方案，包括前期文獻(xiàn)材料調(diào)研、驗(yàn)證目的、驗(yàn)證項(xiàng)目及不同項(xiàng)目驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)；3）開始驗(yàn)證工作，積累收集數(shù)據(jù)及相應(yīng)圖譜；4）對驗(yàn)證的結(jié)果進(jìn)行判斷，評價(jià)分析方法是否通過驗(yàn)證。

溶出度方法學(xué)驗(yàn)證的項(xiàng)目與其他分析方法基本一致，常規(guī)驗(yàn)證項(xiàng)目包括：專屬性、線性及范圍、準(zhǔn)確度、精密度和耐用性等，方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則可參考中國藥典、ICH Q2（A/B）、USP通則<1225>、<1226>、<1092>等。

1. 專屬性

專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、空白輔料等）存在時(shí)，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。專屬性測定環(huán)節(jié)，應(yīng)分別分析加有雜質(zhì)、降解產(chǎn)物等控制成分的樣品和實(shí)際樣品，比較兩組測試結(jié)果，結(jié)果合格的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該為：空白溶劑對主峰的檢測無干擾，不超過1%；主成分與有關(guān)物質(zhì)完全分離，分離度r≥1.5；峰純度符合相應(yīng)規(guī)定。

輔料對專屬性的干擾：空白輔料是指除了活性成分以外的所有輔料和包衣材料，還包括油墨和膠囊殼。具體操作方法可按處方比例配制空白輔料（含油墨或膠囊殼）的混合樣品，將該混合樣品溶解或分散在溶出介質(zhì)中，然后向溶液中加入一定量藥物，作為供試品溶液，可接受標(biāo)準(zhǔn)為：輔料（包括膠囊殼等基質(zhì)）對主峰的檢測無干擾，不能超過2.0%。

對于溶出實(shí)驗(yàn)方法而言，還需要特別注意的一點(diǎn)是：取樣時(shí)所采用的過濾裝置，如濾膜、濾頭等，必須要經(jīng)過藥物的吸附驗(yàn)證，防止對測定結(jié)果產(chǎn)生一定干擾，這一部分應(yīng)在溶出方法開發(fā)階段做充分論證研究。

2. 線性和范圍

可取對照品適量，按照標(biāo)準(zhǔn)方法配置一系列濃度的溶液。一般操作是在容量瓶中配成一定濃度的儲(chǔ)備液，分別精密移取儲(chǔ)備液適量，稀釋成系列濃度的溶液，通常至少使用5個(gè)濃度點(diǎn)（參見<1225>），1225中說明：對原料或成品藥（制劑）的含量測定：一般應(yīng)在測試濃度的80-120%，該范圍是應(yīng)考慮的最小規(guī)定范圍，若超出此范圍，應(yīng)有正當(dāng)理由，主要是根據(jù)劑型的特點(diǎn)；對于溶出度試驗(yàn)，應(yīng)為規(guī)定范圍的±20%，例如如果是控釋制劑，規(guī)定1h后達(dá)到20%，24h達(dá)到90%，它的驗(yàn)證范圍應(yīng)為標(biāo)示量的0-110%。另外，若線性貯備溶液制備過程中為了增加藥物的溶解度，可能會(huì)用到有機(jī)溶劑，除非經(jīng)過驗(yàn)證外，有機(jī)溶劑的量均不得超過總體積的5%（v/v）。

例如取頭孢克肟對照品55.37mg，置100ml容量瓶中配置為儲(chǔ)備液，然后就依次精密移取稀釋成一系列梯度濃度，以濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明頭孢克肟濃度在0.48-477.84μg/ml范圍內(nèi)，進(jìn)樣量在9.34-9337.66ng范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3. 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度即回收率實(shí)驗(yàn)。回收率試驗(yàn)?zāi)康氖强疾觳捎脭M定方法測定結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，且應(yīng)應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。在回收率實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前，USP1092建議：在回收率實(shí)驗(yàn)之前，過濾器、濾膜等對藥物的吸附要進(jìn)行全面評估，同時(shí)要設(shè)法排除由于儀器的玻璃材質(zhì)部分對樣品吸附而對測定結(jié)果造成的干擾影響。

具體的實(shí)驗(yàn)方法包括：在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)；或考慮設(shè)計(jì)至少三種不同濃度，每種濃度至少平行配制3份，用至少9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，回收率驗(yàn)證的濃度范圍一般要求為限度的±20%。兩種分析方法的選定應(yīng)考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。回收率供試樣品溶液配制：按處方比例混合的空白輔料+不同濃度的主成分對照品或原料，再按照擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制溶液，必要時(shí)可超聲使主成分溶解。配制溶劑盡量與溶出介質(zhì)體系一致。如果藥物溶解性較差，可以將藥物溶解在少量有機(jī)溶劑（一般不超過5%）中制備儲(chǔ)備液，并用溶出介質(zhì)稀釋到最終濃度。可接受標(biāo)準(zhǔn)一般為：各濃度下的平均回收率應(yīng)在98%-102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD應(yīng)不大于2.0%。例如取頭孢克肟對照品適量各三份，按照100%比例加入空白輔料，加溶出介質(zhì)振搖溶解，作為50%、75%和100%供試溶液，回收率結(jié)果表明其方法回收率良好。

4. 重復(fù)性

重復(fù)性即在同樣的操作條件下，在較短時(shí)間間隔內(nèi)，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。可在規(guī)定濃度范圍內(nèi)，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品溶液的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)；或設(shè)計(jì)至少三種不同濃度，每種濃度分別制備至少三份供試品溶液進(jìn)行測定，用至少9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)（濃度設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍）。實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中，可能有幾種方法，方法一：取6個(gè)單獨(dú)制劑分別測定溶出度，計(jì)算RSD，但該方法測定時(shí)受制劑個(gè)體差異影響比較大，如果測定結(jié)果重復(fù)性不好，可能是因?yàn)橹苿┖坎町愃鶎?dǎo)致，用該方法時(shí)最好是挑選質(zhì)量較好，例如含量均勻度較好的片劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；方法二即取供試品1片（粒），置于一個(gè)溶出杯中，按照溶出度方法測定，至規(guī)定取樣點(diǎn)時(shí)去處六份供試液分別測定溶出度計(jì)算RSD值。結(jié)果接受標(biāo)準(zhǔn)為RSD不超過2.0%。例如取頭孢克肟顆粒6袋，按照溶出度方法進(jìn)行溶出，30min取溶出液濾過，進(jìn)樣計(jì)算溶出度，結(jié)果表明該溶出測定方法重復(fù)性良好。

5. 中間精密度

中間精密度即在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的條件改變，如不同時(shí)間、不同分析人員、不同設(shè)備等測定結(jié)果之間的精密度。研究過程中的典型的變化，包括不同天、不同操作人員和設(shè)備。USP 1092中建議：可選用同一批次質(zhì)量特征較好的制劑（如較好的含量均勻度）的溶出試驗(yàn)可以由同一實(shí)驗(yàn)室至少兩個(gè)不同的分析人員進(jìn)行，每個(gè)分析人員制備標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶出介質(zhì)和依據(jù)明確的提取和定量步驟進(jìn)行。通常情況下，分析人員用不同的溶出液、分光光度計(jì)或HPLC（包括色譜柱）和自動(dòng)進(jìn)樣器，在不同天進(jìn)行試驗(yàn)。可接受標(biāo)準(zhǔn)：USP 1092建議：當(dāng)該時(shí)間點(diǎn)的溶出量小于85%時(shí)，兩個(gè)分析員溶出結(jié)果的平均值相差不得超過10%；當(dāng)該時(shí)間點(diǎn)的溶出量大于85%時(shí)，兩個(gè)分析員溶出結(jié)果的平均值相差不得超過5%。當(dāng)然，具體的可接受標(biāo)準(zhǔn)可根據(jù)特定產(chǎn)品做具體規(guī)定。

6. 溶液穩(wěn)定性

溶液穩(wěn)定性考察的具體時(shí)間區(qū)間可根據(jù)不同的項(xiàng)目需求去做不同的考察。穩(wěn)定性包括對照品溶液穩(wěn)定性和供試品溶液穩(wěn)定性。對照品溶液穩(wěn)定性：取對照品溶液適量，在室溫下放置，分別于不同時(shí)間點(diǎn)測定吸光度值，計(jì)算其RSD值；供試液穩(wěn)定性：取自制樣品適量，用相應(yīng)介質(zhì)制備成供試液，在室溫下放置，分別于不同設(shè)置時(shí)間點(diǎn)測定吸光度值，計(jì)算其RSD值。對于UV法測定的供試液，一般穩(wěn)定性做到24小時(shí)即可，緩控釋制劑可相對延長時(shí)間；對于HPLC法測定的供試液，一般需滿足一條溶出曲線所有樣品測定完全的時(shí)間。如果溶液不穩(wěn)定，還需要考慮溫度（需要冷藏）、避光（透明容量瓶+棕色容量瓶）、以及容器材料（塑料或玻璃）等對穩(wěn)定性結(jié)果的影響。可接受標(biāo)準(zhǔn)一般為：取每時(shí)間點(diǎn)的吸光度值，計(jì)算其RSD，應(yīng)不大于2%，則說明該溶液在此時(shí)間段內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

7. 耐用性

耐用性主要評估溶出條件故意做微小改變時(shí)對溶出方法耐用性的影響。對于該實(shí)驗(yàn)，最好選用具有較好質(zhì)量特征（如具有較好含量均勻度）的制劑批次進(jìn)行，排除制劑個(gè)體差異對該結(jié)果造成的干擾。HPLC法可根據(jù)具體情況考慮流動(dòng)相組分差異、流速、PH值、色譜柱類型、分離溫度、波長等變化對測定結(jié)果耐用性的影響；UV測定方法可結(jié)合不同項(xiàng)目溶出度方法的具體情況對表面活性劑濃度、pH值、溶出介質(zhì)是否脫氣處理、轉(zhuǎn)速、溫度、體積、取樣時(shí)間、不同型號(hào)品牌的溶出儀等進(jìn)行方法的耐用性研究，對比溶出條件的微小變化對產(chǎn)品測定結(jié)果的影響。例如若選擇的溶出介質(zhì)是緩沖液介質(zhì)體系或是含有表面活性劑的介質(zhì)體系，需要做pH值變化、表面活性劑濃度變化對溶出速度的影響，以確定溶出介質(zhì)的耐用性。根據(jù)品種特點(diǎn)考察耐用性，推薦但不僅限于上述變動(dòng)條件。

8. 溶出均一性

溶出均一性試驗(yàn)包括批內(nèi)均一性和批間均一性。這兩項(xiàng)指標(biāo)既能檢驗(yàn)藥品本身質(zhì)量特性是否符合規(guī)定，同時(shí)也可以檢驗(yàn)溶出方法是否滿足準(zhǔn)確性、精確性良好的要求。批內(nèi)均一性可取同一批次產(chǎn)品的6或12個(gè)劑量單位測定溶出曲線，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)的RSD值。其中，早期的一些取樣時(shí)間點(diǎn)（如5min），要求RSD≤20%；其他時(shí)間點(diǎn)，要求RSD≤10%。批間均一性：取不同批次產(chǎn)品的6或12個(gè)劑量單位測定溶出曲線，比較各批次的溶出曲線是否相似。

綜上，溶出方法驗(yàn)證的一般項(xiàng)目基本如上幾項(xiàng)，當(dāng)然并不局限于該些項(xiàng)目，具體的驗(yàn)證項(xiàng)目及可接受標(biāo)準(zhǔn)可根據(jù)產(chǎn)品自身特點(diǎn)所設(shè)定。

參考文獻(xiàn)：

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