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1 研究背景

2015年2月，美國FDA批準新型復方降糖藥物Glyxambi（恩格列凈/利格列汀）的上市申請，用于2型糖尿病成年患者的輔助治療。該藥也是目前美國唯一的一款SGLT2抑制劑（恩格列凈[empagliflozin]，勃林格殷格翰）和DPP-4抑制劑（利格列汀[linagliptin]，禮來）的復方藥物。

恩格列凈利格列汀片（Ⅰ）（Ⅱ）含有兩種活性成分：恩格列凈和利格列汀（Empagliflozin/Linagliptin），（Ⅰ）每片含恩格列凈10mg和利格列汀5mg；（Ⅱ）每片含恩格列凈25mg和利格列汀5mg。

恩格列凈化學結構如下：

利格列汀化學結構如下：

根據2020版中國藥典四部通則0941 含量均勻度檢查法可知，除另有規定外，片劑、硬膠囊劑、顆粒劑或散劑等，每一個單劑標示量小于25mg或主藥含量小于每一個單劑重量25%者，均應檢查含量均勻度。本品為復方固體口服制劑，含恩格列凈和利格列汀兩種活性成分，其制劑包括10mg/5mg和25mg/5mg兩種規格（其中10mg和25mg均為恩格列凈規格、5mg為利格列汀規格），片重均為185mg，即兩種規格制劑的兩個主藥含量均小于每一個單劑重量25%，應檢查其含量均勻度，考察單劑量的固體制劑含量符合標示量的程度。

2 方法開發思路

本品含量均勻度檢測方法參考原料藥和單方制劑含量檢測方法，復方有關物質檢測方法以及溶出度檢測方法色譜條件，初步選定苯基柱檢測兩種主成分含量，計算方式采用單點外標法（兩個規格，即采用兩個對照），其色譜條件的篩選、前處理條件以及溶液配制的確定，詳見下文。

2.1 色譜條件的確定

（1）研究過程

分別稱取適量恩格列凈和利格列汀對照品，置于同一容量瓶中，加入適量稀釋溶劑（pH2.5磷酸鹽緩沖液：乙腈=70:30）使溶解，制成每1ml中約含利格列汀0.010mg和恩格列凈0.050mg的混合對照品溶液。精密量取上述溶液10μl注入液相色譜儀，分別按下表色譜條件進行樣品分析，記錄色譜圖。

（2）結果與討論

由以上色譜圖可知，1）增加苯基柱可明顯調整各主成分的保留時間，因①條件下兩成分出峰時間較晚，故嘗試通過增加柱流速或提高有機相比例的方式，縮短整體的分析時間；2）增加柱流速對于恩格列凈色譜峰型和保留時間沒有明顯改善；3）色譜條件③下，利格列汀出峰時間為3.551min（對稱因子0.83），恩格列凈出峰時間調整為6.858min（對稱因子1.11），出峰時間差△TR<3.5min；4）目前各成分峰高較為合適（均在100mAU，推測其恩格列凈濃度為0.020mg/ml時響應峰高約為50mAU），故可暫定為恩格列凈利格列汀片含量檢測方法色譜條件。

對暫定恩格列凈利格列汀片含量檢測方法的色譜條件進行簡單驗證（系統適用性、專屬性和線性），結果見下表。

相對濃度1：相對10mg/5mg規格恩格列凈供試品溶液（20μg/ml）的相對濃度；

相對濃度2：相對25mg/5mg規格恩格列凈供試品溶液（50μg/ml）的相對濃度；

相對濃度：相對利格列汀供試品溶液（10μg/ml）的相對濃度

由上表可知，1）本法系統適用性和專屬性均可滿足要求；2）10mg/5mg規格制劑供試品溶液濃度定為恩格列凈0.020mg/ml、利格列汀0.010mg/ml，25mg/5mg規格制劑供試品溶液濃度定為恩格列凈0.050mg/ml、利格列汀0.010mg/ml，本法在恩格列凈0.010mg/ml~0.1mg/ml（相對10mg/5mg規格供試品溶液濃度為50%~489%、相對25mg/5mg規格供試品溶液濃度為20%~200%），利格列汀0.005mg/ml~0.020mg/ml（相對濃度50%~200%）范圍內，線性較好，故可作為恩格列凈利格列汀片含量檢測方法色譜條件。

2.2 前處理條件的確定

本品處方組成與單方制劑利格列汀片較為接近，推測其輔料干擾和提取難度較為接近；另對比恩格列凈片自擬含量檢測方法前處理條件和利格列汀片進口注冊標準含量檢測方法前處理參數如下。

由上表參數推測本品中利格列汀提取難度大于恩格列凈，故為考察提取參數（為簡化操作，將超聲后磁性攪拌調整為室溫下振搖）考察本品含量提取超聲或振搖時間，考察結果見下表。

由上表可知，確定本品含量測定前處理條件為超聲15min，再室溫振搖30min。由上表參數推測本品中利格列汀提取難度大于恩格列凈，故為考察提取參數（為簡化操作，將超聲后磁性攪拌調整為室溫下振搖）考察本品含量提取超聲或振搖時間，考察結果見下表。另對其濾過驗證試驗進行考察，結果如下。

由上表可知，過濾不同體積制備所得供試品溶液與離心制備所得供試品溶液測得各成分峰面積無明顯變化，即無明顯濾膜吸附。

基于以上，確定前處理條件為取本品1片，置于20ml量瓶中，加溶劑（磷酸鹽溶液[取無水磷酸二氫鉀2.0g，加水1000ml使溶解，并用磷酸調節PH值至2.5±0.1]-乙腈（70:30））適量，超聲15min，再室溫振搖30min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm尼龍濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液1.0ml置于25ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

3 檢測方法

照高效液相色譜法（ChP 2020版四部通則0512）測定。

供試品溶液  取本品1片，置于20ml量瓶中，加溶劑（磷酸鹽溶液[取無水磷酸二氫鉀2.0g，加水1000ml使溶解，并用磷酸調節PH值至2.5±0.1]-乙腈（70:30））適量，超聲15分鐘，再室溫振搖30分鐘，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45µm尼龍濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液1.0ml，置于25ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

恩格列凈對照品貯備液  稱取恩格列凈對照品約10mg，精密稱定，置于20ml棕色量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，混勻

利格列汀對照品貯備液  稱取利格列汀對照品約10mg，精密稱定，置于100ml棕色量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，混勻。

對照品溶液（Ⅰ）  分別精密移取恩格列凈和利格列汀對照品貯備液2.0ml和5.0ml置于同一50ml棕色量瓶中，加溶劑稀釋制成每1ml中約含20μg恩格列凈和10μg利格列汀的溶液；

對照品溶液（Ⅱ）  分別精密移取恩格列凈和利格列汀對照品貯備液2.0ml置于同一20ml棕色量瓶中，加溶劑稀釋制成每1ml中約含50μg恩格列凈和10μg利格列汀的溶液。

色譜條件  用苯基鍵合硅膠為填充劑[如WelchUltimate XB Phenyl柱（4.6×150mm，5.0μm）]；以磷酸鹽溶液[取無水磷酸二氫鉀2.0g，加水1000ml使溶解，并用磷酸調節PH值至2.5±0.1]-乙腈（65:35）為流動相；流速為1.0ml/min，柱溫為40℃，檢測波長為224nm，進樣體積10μl。

系統適用性要求  對照品溶液（Ⅰ）（Ⅱ）重復進樣5次所得依帕列凈和利格列汀峰面積的相對標準偏差均應不大于2.0%

測定法  精密量取對照品溶液（Ⅰ）（Ⅱ）和供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積分別計算恩格列凈列凈和利格列汀的含量，應符合規定（ChP 2020版四部通則0941）。

4 方法驗證

為保證恩格列凈利格列汀片含量均勻度檢測方法的準確性和可靠性，根據ChP2020版四部通則9101《分析方法驗證指導原則》和ICH Q2（R1）的指導原則，制定方法學驗證方案，對恩格列凈利格列汀片含量檢測方法進行方法學驗證，驗證結果如下表所示。

5 多批次樣品檢測結果

根據藥典要求，取各批供試品10個，照上述含量測定法，分別測定每一個單劑以標示量為100的相對含量，求其均值和標準差S以及標示量與均值之差的絕對值A。若A+2.2S≤15.0，則供試品的含量均勻度符合規定。檢測結果見下表。

6 結論

基于以上研究可知，該方法通過專屬性、線性、回收率、方法重現性及溶液穩定性等方法學驗證試驗，顯示方法可行，多批次樣品檢測結果均符合藥典標準。