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本文主要介紹了江蘇默樂生物科技股份有限公司研發的醫療器械“幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）”的臨床前研發實驗。

一、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的產品主要組成成分

檢測緩沖液、引物探針、混合酶液、強陽性質控品、弱陽性質控品、陰性質控品。

二、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的預期用途

用于檢測人胃黏膜組織樣本中幽門螺桿菌 23S rRNA 基因A2143G、A2143C 和 A2144G 突變和 gyrA 基因 261A、261G、 

260T、271A、271T、272G 突變。 

本試劑盒用于幽門螺桿菌克拉霉素耐藥（23S rRNA 基因突變）和喹諾酮類抗生素耐藥（gyrA 基因突變）的臨床輔助診斷，為臨床醫生評估個體中幽門螺桿菌的耐藥性提供參考。試劑盒適用于幽門螺桿菌感染者且臨床認為有必要采用胃粘膜組織進行幽門螺桿菌耐藥診斷的患者。未與具體藥品進行相關臨床試驗，本試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不得作為確診或排除的唯一依據。 

三、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的型號/規格

50 測試/盒 

四、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的產品檢驗原理

采用聚合酶鏈式反應（PCR）結合Taqman熒光探針技術對人胃黏膜組織樣本中的幽門螺桿菌及耐藥突變的鑒別檢測。針對幽門螺桿菌克拉霉素耐藥基因（23S rRNA基因）與喹諾酮類抗生素耐藥基因（gyrA基因）的突變位點設計引物探針，采用FAM熒光標記克拉霉素耐藥基因突變，采用HEX熒光標記喹諾酮類抗生素耐藥基因突變。包含與克拉霉素耐藥相關的23S rRNA基因的3種突變和與喹諾酮類抗生素耐藥相關的gyrA基因的6種突變 。

五、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的主要原材料

本產品的主要原材料包括：引物、探針、HS Taq DNA 聚合酶、 UNG 酶、 dNTPs、質粒等，這些原材料均通過外購的方式獲得。 

引物和探針均由江蘇默樂自行設計后，由專業的合成公司合成。 江蘇默樂對主要原材料進行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量 標準并經檢驗合格。企業參考品設置情況：江蘇默樂設計了完整的企業參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢測限參考品、精密度參考品以及突變檢測限參考品。企業參考品的主要原料為幽門螺桿菌菌液、臨床樣本核酸、質粒等。參考品組成如下：

Hp 陽性參考品 10 份；Hp 陰性參考品 10 份；包含所有位點的最低檢測限參考品 30 份；Hp 精密度參考品 1 份；突變檢測限 

參考品 18 份。以上企業參考品均含有一定濃度的人類基因組DNA 作為內標。 

企業參考品所采用臨床樣本采用基因測序的方法進行確認。企業參考品用于產品特異性、靈敏度、最低檢測限、精密度及突變檢測限檢測。

六、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的生產工藝及反應體系研究

江蘇默樂根據試劑盒中試劑及成分的主要生產工藝研究結果，確定了最佳的生產工藝。試劑盒反應體系的研究中，包含了臨床樣本的核酸提取與 PCR 擴增反應等。其中核酸提取研究包括核酸純度、核酸完整性、重復性以及取樣部位、取樣大小等。PCR 擴增的反應體系研究包括引物探針濃度、 dNTPs 濃度、DNA 聚合酶濃度、鎂離子濃度、BSA 濃度、丙三醇濃度以及PCR反應程序優化等。通過一系列功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。

七、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的分析性能評估 

該產品分析性能包括靈敏度、準確度、特異性（交叉反應、干擾物質）、精密度等。此外，還研究了配套使用的核酸提取試劑的性能。江蘇默樂提交了有效運行的質量管理體系下生產的 三 批 產 品 在適用機型 ABI7500 熒光 PCR 儀與上海宏石SLAN-96P 上進行的性能評估資料。在靈敏度的性能評估中，進行了最低檢測限與突變率檢測限的確定和驗證。 

最低檢測限的確定和驗證：江蘇默樂采用臨床樣本培養物對每個突變位點分別建立檢出限。選取分別具有 23S rRNA 基因2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G 突變的菌液，每種突變菌株分別稀釋至不同濃度，使用 3 批試劑對每一濃度重復檢測 20 次，以此確定試劑盒的最低檢出限，結果顯示：具有 95%以上陽性檢出率的樣本濃度均不高于 1×104 copies/mL。江蘇默樂進一步選取 10 例具有不同突變類型的臨床培養物，并使用幽門螺桿菌陰性樣本稀釋至1×104 copies/mL，在稀釋物中添加不同干擾物質后再檢測，結果顯示，在存在干擾物質的情況下，試劑盒的最低檢出限仍然為1×104 copies/mL。 突變檢測限的確定和驗證：江蘇默樂將不同濃度、具有不同突變類型的核酸與野生核酸按照不同比例進行混合。核酸濃度為 1pg/μL 時，設置突變比例分別為 10%、0.1%和 0.001%，濃度為 0.001pg/μL 時，設置突變比例為 80%、50%和 10%。每種混合核酸均進行 20 次重復，結果顯示，當野生型幽門螺桿菌濃度為 1pg/μL，各突變位點具有 90%以上陽性檢出率的最低突變比例為 0.1%；當野生幽門螺桿菌濃度為 0.001pg/μL，各突變位點具有 90%以上陽性檢出率的最低占比為 50%。江蘇默樂進一步將經測序方法驗證過的、具有不同突變類型的核酸與野生型核酸混合按照一定比例混合后進行檢測，用以驗證突變檢測限。

結果顯示：當野生型幽門螺桿菌濃度為 1pg/μL，0.1%突變比例條件下，各突變位點均能 100%檢出；當野生幽門螺桿菌濃度為 

0.001pg/μL，50%突變比例條件下，各突變位點均能 100%檢出。 

在準確度的性能評估中，使用 3 批試劑對企業陽性參考品和陰性參考品進行檢測。檢測結果表明，陽性符合率和陰性符 

合率均為 100%。 

在交叉反應的性能評估中，使用 3 批試劑檢測胃腸道常見的其他病原微生物，如蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯桿菌肺炎、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、類志賀鄰單胞菌、流感嗜血桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、腦膜炎奈瑟菌、結核分枝桿菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌、變形桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌等，檢測結果均為陰性。 

在干擾物質的性能評估中，采用向弱陽性樣本中加入干擾物質的方法進行驗證，實驗結果顯示，常見干擾物質如血紅蛋白（1000.0 mg/L）、粘蛋白（2000.0 mg/L）、白細胞（109個/L）阿莫西林（0.75mg/L）、克拉霉素（0.29mg/L）、左氧氟沙星（1.62mg/L）、四環素（5.0mg/L）、甲硝唑（40.0mg/L）、奧美拉唑（0.4mg/L）、雷貝拉唑（0.802mg/L）、蘭索拉唑（1.15mg/L）、 泮托拉唑（3.81mg/L）、枸櫞酸鉍鉀（67.85mg/L）、阿司匹林 （ 300.0mg/L ）、 對 乙 酰 氨 基 酚 （ 13.824mg/L ）、 鋁 碳 酸 鎂 （1500.0mg/L）、乳酸菌素（3600.0mg/L）和胃康靈（100.0mg/L） 等在上述濃度時對本試劑的檢測結果沒有影響。 

在精密度的性能評估中，選擇 10 例具有不同突變類型的 樣本，并稀釋至不同濃度，在 20 天內，每天由 2 人分別進行 2 個輪次的檢測，每一次檢測做 3 個重復。檢測結果顯示：批內、 批間、日內、日間、儀器間以及操作者間的變異系數 CV 均小 于 5%。 

本次申報產品包括 1 種包裝規格（50 測試/盒），2 種實時 熒光定量 PCR 儀適用機型（ABI7500 與上海宏石 SLAN-96P）， 江蘇默樂提供了三批產品在適用機型上的性能評估資料。

八、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的陽性判斷值研究 

江蘇默樂選取胃粘膜組織臨床樣本，包含 23S rRNA 基因 2143C/2143G/2144G 和 gyrA 基因 261G/261A/260T/271A/271T/ 

272G 不同突變的樣本，對檢測結果進行 ROC 曲線分析，結果 顯示：幽門螺桿菌克拉霉素耐藥基因突變檢測 FAM 熒光 Ct 值

的參考值為 35.04；幽門螺桿菌喹諾酮類抗生素耐藥基因突變HEX 熒光 Ct 值的參考值為 35.73。本試劑盒使用人源基因作為 

試劑盒內標，確定內標 CY5 熒光 Ct 值的參考值為 32.00。同時， 將本試劑盒檢測結果進一步與臨床培養藥敏實驗結果進行了比 

較，驗證了試劑陽性判斷值的合理性。 

九、幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變 檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的穩定性研究 

江蘇默樂對本產品的實時穩定性、運輸穩定性、開瓶穩定性、凍融穩定性、胃黏膜組織樣本的穩定性以及核酸的穩定性進行了研究，確定了在各種條件下本產品及樣本的有效保存時間。 

實時穩定性的研究：采用三批試劑進行研究，將本試劑盒避光密閉保存在-20±5℃條件下，分別在第 0、1、2、3、6、9、 12、13 月取出檢測，檢測的樣本類型包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、精密度參考品等企業參考品，以從準確度、特異性、檢測限、精密度等方面綜合驗證試劑盒的穩定程度。檢測結果表明，各項性能指標均符合要求，確定產品在規定的儲存條件下，可穩定保存 12 個月。 

此外，江蘇默樂對產品的運輸穩定性、開瓶穩定性、凍融穩定性、樣本及核酸穩定性分別進行了研究。結果顯示，產品的性能均滿足產品說明書的聲稱。