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# 概述

為了防止醫療器械在臨床使用時引起不良反應，醫療器械生產商需要根據ISO或者GB/T提供的相關標準進行生物相容性評估。作為生物相容性測試的重要組成部分，體外細胞毒性試驗具有通用性，廣泛適用于各種醫療器械和材料的評價。該測試并不是單一的試驗方法，而是規定一個試驗方案，需要在一系列試驗步驟中判斷，以選出最合適的試驗。細胞毒性根據檢測終點可以分為：形態觀察，細胞增殖，細胞代謝。常見的細胞毒性試驗有：細胞 MEM 洗脫試驗，MTT細胞毒性試驗，直接接觸法細胞毒性試驗，中性紅攝取細胞毒性試驗，克隆形成細胞毒性試驗，瓊脂擴散法細胞毒性試驗，相對增殖度法細胞毒性試驗，XTT細胞毒性試驗等。

培養中的細胞

細胞毒性的判斷

細胞毒性測試是最常用的生物相容性測試，主要測試化學物質存在于浸提液中的化學物質可能會對細胞的形態、增殖等方面產生的影響。根據GB 16886.1標準，無論臨床用途如何，只要與人直接或間接接觸，該測試是推薦做的。在眾多生物相容性測試中，細胞毒性試驗成本低，測試較為簡單，周期相對短，并且不必使用動物。但是該項測試因一般使用體外細胞系，測試系統非常敏感，在生物相容性測試失敗的產品案例中細胞毒性占多數，所以生產商應當對該項試驗格外重視。在ISO， GB/T， USP，YBB， ASTM中均有具體的細胞毒性測試方法，所謂細胞毒性陽性或者失敗，全面的說法應該是在哪一個標準下哪一個試驗類型中測試結果為陽性。

常見的細胞毒性試驗結果判定總結如下：

MTT 細胞毒性試驗顯色

影響細胞毒性的因素舉例

pH

由于大多數細胞適宜生存的pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細胞生長將產生有害的影響。產品生產或者加工工藝中引入的酸或者堿都會通過浸提進入培養基。一般細胞毒性試驗使用的貼壁細胞如L-929，會因pH的波動停止生長或者出現形態變圓、皺縮，從而表現出顯著細胞毒性。

金屬

用于醫療器械制造的金屬，如銅、鉻和鋅，是人體某些酶發揮作用所必需的。然而，在較高的劑量或者通過某些途徑暴露時，這些金屬可能導致中毒，在體內引起局部和全身的不良反應。鎘，鈷、鎳、鋁和鈦離子已被證明具有誘變作用，并根據暴露的劑量和途徑被歸為具有可能或已證明的致癌元素。金屬離子往往還是影響細胞滲透壓的主要因素。病患接觸到的金屬/化合物的劑量決定了該金屬/化合物是否會引起毒性，是否含有該類成分不是引起毒性的充分條件。金屬離子會氧化攻擊細胞內部的重要結構成分，產生活性自由基（例如，活性氧或氮物質），可以對細胞核、蛋白質、和/或脂質產生毒性。例如，Cr顯示為強效羥基自由基金屬，會導致DNA鏈斷裂。然而值得注意的是，六價鉻比三價鉻遺傳毒性高四倍，研究表明一些金屬離子，如Co和 Ni，可以直接與 DNA 聚合酶結合，或者影響其保真度增加將不正確的核苷酸摻入新合成的 DNA鏈的幾率。金屬離子導致細胞毒性有很多途徑，目前仍在研究中。如下是常見金屬離子在L929細胞系中的IC50信息[8]。

增塑劑

市場上許多醫療器械是塑料制品如血袋，管路，注射器，該類產品絕大部分需要是要加增塑劑，如鄰苯二甲酸物質，丙二酚，以增加柔韌性和彈性。鄰苯二甲酸酯(DEHP)及其代謝產物會引起一定毒性如內分泌紊亂。其替代物還有對苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHT)，偏苯三酸三辛酯(TOTM)，非鄰苯二甲酸類還有1,2-環己烷二甲酸二異壬酯（DINCH）、雙（2-乙基己基）己二酸、乙酰基檸檬酸三丁酯等。每一種增塑劑從材料中遷移的速率取決于增塑劑和嵌入塑料的特性。不同增塑劑在50%乙醇溶液中從PVC管中提取的遷移率有很大差異，TOTM的釋放率比DEHP低20倍。DEHT從PVC浸提出的速度比DEHP小三倍。根據于醫療器械的特性，其他因素也可能影響塑化劑的釋放，如PVC輸液管路的流速。

最常見的MEHPs，對苯二甲酸單(2-乙基己基)酯，2-乙基己二酸單-2-乙基己二酸，單-鄰苯二甲酸異壬基酯，會比母體增塑劑(DEHP, DINP和DINCH)更容易引起 對L929細胞更強的細胞毒性表現。MEHPs已被證明在濃度低至0.01 mg/mL(10µg/mL或10 ppm)時就可能影響細胞活力[8]。

增塑劑舉例及其IC50數據信息見下表：

滲透壓

滲透壓是溶液本身的一種性質，所謂溶液滲透壓，簡單來說，是指溶液中溶質微粒對水的吸引力。溶液滲透壓的大小取決于單位體積溶液中溶質微粒的數目，溶質微粒越多，即溶液濃度越高，對水的吸引力越大，溶液滲透壓越高；反過來，溶液微粒少，即溶液濃度越低，溶液滲透壓越低。一般來說可溶物均對滲透壓有一定的影響。常規培養基能夠給細胞毒性試驗所用的細胞系穩定的增殖環境，但是當醫療器械浸提液將此平衡打破，細胞的正常增殖將會受到影響，因此沒有高毒性或者特定毒性機制的金屬離子，酸根離子等也會在某些濃度影響細胞毒性。

如何看待細胞毒性

因毒性皺縮變圓的細胞

作為一個較為敏感的檢測終點，是否能通過細胞毒性測試是監管高度關注的問題。醫療器械可能含有醛類、醇類、金屬離子、增塑劑或其他可能對其產生細胞毒性作用的材料，這些細胞毒性試驗的結果說明了是細胞在接觸對某些化學物質有很大的反應。然而，這些效應并不總是與體內全身毒性或臨床效應相關，盡管細胞毒性試驗有一定的局限，但它是一項強制性試驗，在提交市場許可之前，必須對每個醫療器械進行測試。如直接接觸法細胞毒性試驗、克隆形成法細胞毒性試驗、如MEM洗脫試驗、中性紅試驗和MTT試驗，可以提供有價值的體外細胞毒性的數據，但往往高估了可能引起的體內不良反應，因此并不總是準確有效的對應臨床反應。基于細胞的測試方法所表現出的毒性不一定說明在動物體內或者臨床患者身上引起毒性，例如，一些醫療器械浸提出的可溶性金屬離子（例如，鈉、銅、鎳）通過改變細胞生長環境對細胞產生毒性；但是這些離子在臨床上患者的耐受性可能足夠高其影響可忽略不計。在這些情況下，可通過分析化學方法，如化學表征(可浸提/瀝濾物測試)，結合已發表、同行評議的科學論文的現有毒性數據，分析原因，分析試驗方法，為患者提供一個毒理學風險和臨床安全的評估。