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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2022-07-26 14:43
引言
有關(guān)物質(zhì)泛指在藥品的生產(chǎn)與儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)或降解產(chǎn)物。一個(gè)經(jīng)過嚴(yán)格驗(yàn)證的方法才能更有效地控制產(chǎn)品的純度，進(jìn)而降低毒副作用的產(chǎn)生。我們對(duì)有關(guān)物質(zhì)的控制方法一般為面積歸一化法、加校正因子的自身對(duì)照法和外標(biāo)法。
《中國(guó)藥典》2015年版，在《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中新增了對(duì)校正因子的驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)驗(yàn)證結(jié)果做了嚴(yán)格的規(guī)定。現(xiàn)就加校正因子的自身對(duì)照法驗(yàn)證方式和可接受范圍結(jié)合自身工作經(jīng)歷提出一些看法，供大家參考。
1. 專屬性
專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在下，采用的分析方法能正確測(cè)定被測(cè)物的能力。有關(guān)物質(zhì)方法的專屬性實(shí)驗(yàn)一般包括空白干擾實(shí)驗(yàn)、系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)和降解實(shí)驗(yàn)三部分。
1.1 空白干擾實(shí)驗(yàn) 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心《藥品技術(shù)評(píng)價(jià)文集（第二輯）》要求空白無(wú)干擾，即空白溶劑或空白輔料不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。
1.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)通常采取分離度實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)行評(píng)估，即根據(jù)已知雜質(zhì)的限度配置限度濃度的加雜供試品溶液，考察已知雜質(zhì)與供試品、各已知雜質(zhì)及已知雜質(zhì)與未知雜質(zhì)間的分離度。要求各已知雜質(zhì)與供試品及已知雜質(zhì)間達(dá)到基線分離，已知雜質(zhì)與未知雜質(zhì)間的分離度大于1.0。
1.3 降解實(shí)驗(yàn) 將供試品在較為劇烈即在酸、堿、氧化、高溫（干熱和濕熱）、光照等條件下進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕到膺M(jìn)而考察方法的可行性。
1.3.1 降解程度 RagineMaheswaran推薦的降解強(qiáng)度為5%～20%；《化學(xué)藥物分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容和評(píng)價(jià)》中的推薦值為20%～30%；《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊(cè)》的推薦值為5%～10%。強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)是模擬藥品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和使用過程中的極端條件，現(xiàn)實(shí)中是極難發(fā)生的，同時(shí)如果過度降解極有可能造成二次降解致使物料不平衡故建議以低強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間（最長(zhǎng)時(shí)間不建議超過七天，以三天內(nèi)為宜）的方式進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)以最大可能地模仿現(xiàn)實(shí)條件，降解程度以5%～10%為佳，但是對(duì)于降解條件已較為劇烈卻仍未降解的建議不再加劇降解條件，如各條件均未產(chǎn)生降解產(chǎn)物的建議對(duì)相對(duì)較不穩(wěn)定的條件加以復(fù)合條件進(jìn)行進(jìn)一步考察，以期望能有一條件出現(xiàn)降解產(chǎn)物以驗(yàn)證方法的專屬性，如復(fù)合條件亦無(wú)降解產(chǎn)物產(chǎn)生則不再?gòu)?qiáng)求。
1.3.2 分離度 參照系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)要求，主峰與相鄰雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，已知雜質(zhì)與未知雜質(zhì)及各未知雜質(zhì)間分離度大于1.0。
1.3.3 峰純度 峰純度主要是考察被分析峰中是否包含其他物質(zhì)，現(xiàn)有儀器參數(shù)具有一定的局限性，無(wú)法完全真實(shí)地反應(yīng)實(shí)際情況，參考現(xiàn)有儀器的表示方法建議規(guī)定主峰純度因子不小于990，或者純度閾值大于純度角。
1.3.3 質(zhì)量守恒 《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊(cè)（第四版）》與《藥品技術(shù)評(píng)價(jià)文集（第三輯）》中均要求在±10%以內(nèi)，本人認(rèn)為范圍過寬，如果排除人為誤差，單單考慮儀器的誤差將其定在±2%以內(nèi)是比較合理的，但是考慮到降解程度為5%～10%，同時(shí)考慮到人為誤差、儀器誤差及校正因子因素，建議帶入校正因子后將其定為±5%是更合理的。
2. 準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度系指采用該測(cè)定方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。驗(yàn)證時(shí)一般要求根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的定量限與該雜質(zhì)的限度分別配制三個(gè)濃度的供試品溶液各三份（如LOQ、50%、100%、150%）的同時(shí)配制自身對(duì)照溶液，按外標(biāo)法和加校正因子的自身對(duì)照法分別測(cè)定其含量，將外標(biāo)法測(cè)得值換算成百分含量與加校正因子的自身對(duì)照法的測(cè)量值進(jìn)行比較以考察校正因子的準(zhǔn)確度，將外標(biāo)法的實(shí)測(cè)值與理論值比較，計(jì)算回收率，并計(jì)算回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以考察方法的準(zhǔn)確度。
參照ICH Q3A的相關(guān)要求，并結(jié)合質(zhì)量研究的實(shí)際情況，對(duì)校正因子的準(zhǔn)確度擬定如下可接受范圍（X表示測(cè)得的雜質(zhì)含量）：
① 當(dāng)X＜0.05%，兩測(cè)量值不做比較；
② 當(dāng)0.05%≤X＜0.10%，兩測(cè)量值的差值在0.05%內(nèi)；
③ 當(dāng)0.10%≤X＜0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.10%內(nèi)；
④ 當(dāng)X≥0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.20%內(nèi)。
《藥品技術(shù)評(píng)價(jià)文集（第二輯）》中規(guī)定各濃度下的平均回收率應(yīng)在80%～120%，LOQ濃度下的平均回收率應(yīng)在70%～130%，RSD不大于10%，此范圍過于寬泛，而2015年版《中國(guó)藥典》要求過于苛刻，極難達(dá)到，結(jié)合實(shí)際工作，對(duì)方法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)擬定如下可接受范圍：
① LOQ濃度水平，每個(gè)樣品的回收率均在85%～110%；
② LOQ以上濃度水平，每個(gè)樣品的回收率均在92%～105%；
③ 含LOQ濃度各樣品回收率的RSD應(yīng)不大于10%，LOQ濃度水平以上的各樣品回收率的RSD應(yīng)不大于5%。
3.精密度
精密度系指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度。
一般我們采用加限度雜質(zhì)濃度的供試品溶液，平行配制6份，按外標(biāo)法和加校正因子的自身對(duì)照法分別測(cè)定已知雜質(zhì)的含量。
校正因子的重復(fù)性和中間精密度擬定可接受標(biāo)準(zhǔn)為（X表示測(cè)得的雜質(zhì)含量）：
① 當(dāng)X＜0.05%，兩測(cè)量值不做比較；
② 當(dāng)0.05%≤X＜0.10%，兩測(cè)量值的差值在0.05%內(nèi)；
③ 當(dāng)0.10%≤X＜0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.10%內(nèi)；
④ 當(dāng)X≥0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.20%內(nèi)。
《藥品技術(shù)評(píng)價(jià)文集（第二輯）》中規(guī)定重復(fù)性RSD不大于15%，重復(fù)性和中間精密度12份數(shù)據(jù)RSD不大于20%，范圍過于寬泛。參照2015年版《中國(guó)藥典》通則9101的精密度和ICH Q3A的相關(guān)要求，并結(jié)合實(shí)際工作，擬定可接受標(biāo)準(zhǔn)為：
① 當(dāng)X＜0.05%，不計(jì)算RSD；
② 當(dāng)0.05%≤X＜0.10%，RSD不得過4，不同實(shí)驗(yàn)人員測(cè)得值得RSD不得過8或差值不得過0.05%；
③ 當(dāng)0.10%≤X＜0.50%，RSD不得過3，不同實(shí)驗(yàn)人員測(cè)得值得RSD不得過6或差值不得過0.10%；
④ 當(dāng)X≥0.50%，RSD不得過2，不同實(shí)驗(yàn)人員測(cè)得值得RSD不得過4或差值不得過0.20%。
4.線性
系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值與試樣中被測(cè)物濃度呈比例關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系。可用同一對(duì)照品貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5份不同濃度的對(duì)照品溶液。線性濃度溶液建議從定量限至限度濃度的200%。每份樣品溶液進(jìn)樣一針， 以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)被測(cè)物的濃度作圖進(jìn)行線性回歸，列出線性方程、線性圖、相關(guān)系數(shù)、響應(yīng)因子、y軸峰面積的截距及剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差。
《藥品技術(shù)評(píng)價(jià)文集（第二輯）》中規(guī)定相關(guān)系數(shù)不小于0.990，y軸截距應(yīng)在100%峰面積的25%以內(nèi)，響應(yīng)因子的RSD不大于10%；《2010年版-實(shí)驗(yàn)室控制系統(tǒng)GMP實(shí)施指南》中規(guī)定相關(guān)系數(shù)原料不小于0.998、制劑不小于0.990，y軸截距應(yīng)在100%峰面積的25%以內(nèi)，當(dāng)限度小于0.5%時(shí)剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%。結(jié)合現(xiàn)有研發(fā)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，擬定如下標(biāo)準(zhǔn)：
① 相關(guān)系數(shù)不小于0.999
② y軸截距不大于100%濃度峰面積的10%
③ 響應(yīng)因子的RSD不大于5%
④ 剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%
根據(jù)線性方程的斜率（k）比計(jì)算校正因子。即校正因子=k主成分/k雜質(zhì)。其可接受標(biāo)準(zhǔn)為：
① 校正因子在0.9～1.1之間修約為1.0，當(dāng)其小于0.9時(shí)保留小數(shù)點(diǎn)后兩位，當(dāng)其大于1.1時(shí)保留小數(shù)點(diǎn)后一位,另有規(guī)定的除外；
② 當(dāng)校正因子為法定標(biāo)準(zhǔn)收載的，偏差在10%以內(nèi)取法定標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值，若偏差大于10%應(yīng)考察其原因，經(jīng)分析為非方法和人為誤差引入的，則按實(shí)際測(cè)定值作為校正因子；
③ 當(dāng)校正因子在0.2～5.0之外時(shí)需要考察方法是否需要可行或更換為雜質(zhì)外標(biāo)法。
5. 定量限和檢測(cè)限
定量限（LOQ）是指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低值；檢測(cè)限（LOD）是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。方法分為直觀法、信噪比法和基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法。
我們最常使用的是信噪比法，本人更推薦直觀法，因?yàn)槠涓?jiǎn)單直接，只要靈敏度足夠好，直觀法更有利于操作的簡(jiǎn)便性和驗(yàn)證項(xiàng)目的通過（如定量限回收率的測(cè)定）。現(xiàn)就常用的信噪比法擬定如下標(biāo)準(zhǔn)：
① LOD和LOQ的信噪比分別擬定為2～4和8～12，在保證靈敏度的情況下可以將其適當(dāng)放寬至2～6和8～15；
② LOQ濃度樣品連續(xù)進(jìn)樣6次峰面積的RSD不得過10%
③ LOQ一般為限度濃度的十分之一，最差為限度濃度的二分之一同時(shí)滿足低于報(bào)告限濃度，考慮到常規(guī)藥品的最大日劑量是小于2g的現(xiàn)狀，LOQ應(yīng)小于供試品溶液濃度的0.05%。
6.耐用性
系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的成熟程度。
6.1 溶液穩(wěn)定性
一般我們需要對(duì)供試品溶液、對(duì)照品溶液及對(duì)照溶液進(jìn)行穩(wěn)定性考察，考察時(shí)間取決于實(shí)際樣品檢測(cè)最長(zhǎng)時(shí)間、方法學(xué)驗(yàn)證項(xiàng)目中耗時(shí)最長(zhǎng)項(xiàng)目時(shí)間（一般為耐用性）及溶液是否出現(xiàn)不穩(wěn)定性。對(duì)于溶液穩(wěn)定性小于4h的樣品應(yīng)臨用新制并立即進(jìn)樣，低于2h的應(yīng)考慮更換溶劑、改變放置條件（如進(jìn)樣盤控溫）或更改檢測(cè)方法。
對(duì)于對(duì)照品及對(duì)照溶液建議采用主成分峰面積RSD不大于2%進(jìn)行判斷。對(duì)于供試品溶液由于其雜質(zhì)含量差異較大，如按照峰面積RSD不大于2%進(jìn)行判斷顯然是不合理的，對(duì)其建議采用面積歸一化法進(jìn)行判斷，并符合以下標(biāo)準(zhǔn)即認(rèn)為供試品溶液是穩(wěn)定的（X為面積歸一化法計(jì)算雜質(zhì)的含量）：
① 當(dāng)X＜0.05%，兩測(cè)量值不做比較；
② 當(dāng)0.05%≤X＜0.10%，兩測(cè)量值的差值在0.05%內(nèi)；
③ 當(dāng)0.10%≤X＜0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.10%內(nèi)；
④ 當(dāng)X≥0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.20%內(nèi)。
6.2 耐用性試驗(yàn)
一般選擇對(duì)3～5個(gè)相關(guān)的測(cè)定條件進(jìn)行微小的變動(dòng)，一般對(duì)下列條件進(jìn)行微小的改變，流動(dòng)相比例（±5%，如為兩項(xiàng)預(yù)混流動(dòng)相，則起始比例的改變不得超過低比例流動(dòng)相的10%）、pH值（±0.2）、波長(zhǎng)（±2nm）、不同品牌或同一品牌不同批次的同類型色譜柱、緩沖鹽濃度（±5nmol）、柱溫（±5℃）、流速（±0.1ml/min）等。按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)要求取空白干擾溶液、系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液、對(duì)照溶液等進(jìn)樣，考察色譜條件微小改變后空白干擾現(xiàn)象、系統(tǒng)適用性（以分離度為主，拖尾因子、理論板數(shù)等為輔）及各雜質(zhì)的含量的變化情況。
校正因子的耐用性結(jié)果良好結(jié)果要求參照精密度項(xiàng)下要求即以外標(biāo)法和加校正因子自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量（X）應(yīng)符合以下要求
① 當(dāng)X＜0.05%，兩測(cè)量值不做比較；
② 當(dāng)0.05%≤X＜0.10%，兩測(cè)量值的差值在0.05%內(nèi)；
③ 當(dāng)0.10%≤X＜0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.10%內(nèi)；
④ 當(dāng)X≥0.50%，兩測(cè)量值的差值在0.20%內(nèi)。
耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，需滿足一下標(biāo)準(zhǔn)：
① 空白溶劑或輔料不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定；
② 系統(tǒng)適用性溶液中各已知雜質(zhì)與供試品及已知雜質(zhì)間達(dá)到基線分離，已知雜質(zhì)與未知雜質(zhì)間的分離的大于1.0；
③ 按加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算所得雜質(zhì)的含量（X）滿足校正因子的耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好的要求。
7.范圍
系指分析方法能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。即范圍由精密度、準(zhǔn)確度和線性的結(jié)果所決定。2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定是限度的±20%；ICH Q2規(guī)定是報(bào)告限到限度的120%或者是LOD或LOQ到限度；USP40的規(guī)定是限度的50%至120%。而范圍一般是由線性研究所得，考慮到常規(guī)原料與制劑的限度區(qū)別同時(shí)為了減少工作量，故建議線性范圍為L(zhǎng)OQ至原料限度的300%。
由于2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)有關(guān)物質(zhì)提出了新的驗(yàn)證要求，特別是提出了校正因子的驗(yàn)證要求，但是并沒有相關(guān)的法規(guī)或指導(dǎo)原則對(duì)其進(jìn)行細(xì)化或說明，現(xiàn)根據(jù)實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了簡(jiǎn)單的討論，希望對(duì)大家的工作有所幫助，如有不當(dāng)之處歡迎批評(píng)指正。
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