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嘉峪檢測網 2022-08-10 07:23
摘要
目的 了解我國病原菌多重核酸檢測試劑盒的分析性能的現狀，特別是檢出限性能的基本情況，為相關研發企業和醫療機構使用者提供參考。
方法 根據體外診斷試劑行業標準《細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑盒（標準號YY∕T 1725-2020）》，使用“34種細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑國家參考品（批號370026-201801）”對10種不同檢測技術原理的病原菌多重核酸檢測試劑盒的分析性能做了評估，包括陽性符合率、陰性符合率、重復性及檢出限等進行質量評價，并按照國家參考品的質量標準對評價結果進行統計分析。
結果 10款試劑盒中包括4款呼吸道感染、3款中樞神經感染及3款血流感染試劑盒，檢測范圍或病原譜覆蓋8種革蘭陽性細菌、14種革蘭陰性細菌及10種真菌和非典型病原體。各試劑盒的陽性符合率、陰性符合率、重復性及檢出限等分析性能均符合國家參考品的質量標準。呼吸道、中樞神經及血流感染類試劑盒病原菌譜及檢出限性能差異較大，檢出限的中位值分別為5×103 CFU/ml、1×103 CFU/ml及1×106 CFU/ml；各試劑盒病原菌譜中分布和出現頻率較高的6種病原菌分別為肺炎鏈球菌（檢出限的中位值為5×102 CFU/ml）、金黃色葡萄球菌（3×103 CFU/ml）、流感嗜血桿菌（1×103 CFU/ml）、銅綠假單胞菌（5×104 CFU/ml）、鮑曼不動桿菌（3×106 CFU/ml）及大腸埃希氏菌（5×104 CFU/ml）。結論 我國已經進入體外診斷試劑注冊階段的病原菌多重核酸檢測試劑盒均具有較好的準確性、特異性及重復性；同時，研發企業應注意結合臨床具體的需求，設計合理的試劑盒病原菌譜，并持續優化檢出限性能。
[關鍵詞] 病原菌；多重核酸檢測；參考品；檢出限
病原菌引起的呼吸道、中樞神經系統、血流、胃腸道及生殖道等感染性疾病具有發病急、進展快等特點，且臨床發病率和病死率較高，對人類健康構成嚴重威脅。近年新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）疫情發生以來，臨床繼發性病原菌合并感染更是會嚴重威脅COVID-19患者的生命[1-2]。迅速地確定感染病原體對于患者的治療及預后十分關鍵。盡管目前臨床傳統的病原菌檢測方法仍以培養及表型鑒定為主，分離培養雖然是病原學診斷的“金標準”，但檢測周期長、操作繁瑣、敏感性低等已無法滿足臨床診治的需求。與之相比，分子診斷技術的速度發展，在突發性感染的評估、感染早期的發現、監測及病原菌耐藥基因分析等領域發揮了越來越重要的作用[3-7]。
近年來逐漸發展的病原菌多重核酸檢測技術，即在一個核酸反應體系中同時對多個靶標病原菌進行檢測，更具有操作簡便、覆蓋病原菌譜廣、能夠分辨混合感染等優勢，正受到越來越多的關注和應用。目前，美國FDA已經批準了10余款病原菌多重核酸檢測試劑盒，覆蓋PCR、熔解曲線、恒溫擴增及微陣列核酸芯片等技術原理；我國藥監部門批準了3款試劑盒[8-9]。然而，多重核酸檢測技術仍存在一些局限和挑戰。例如，多重反應體系研發難度較大、試劑盒特異性和靈敏度可能會低于單一靶向反應體系、試驗操作較為繁瑣及檢測成本較高等；另外，相關試劑盒在檢測技術的選擇、檢測范圍或病原譜的設計及檢出限性能的優化等方面也面臨諸多挑戰。因此，為保證病原菌多重核酸檢測試劑盒的質量，應特別重視相關產品的質量控制及評價研究[10]。
2018年至今，僅在中國食品藥品檢定研究院完成注冊檢驗的病原菌多重核酸檢測試劑盒就有將近20款，行業爆發式發展的態勢已然初現。為全面了解我國相關產品分析性能的基本現狀，針對10款進入體外診斷試劑注冊階段的病原菌多重核酸檢測試劑盒的部分分析性能，包括陽性符合率、陰性符合率、重復性及檢出限性能進行了質量評價研究。
01、材料與方法
1.1 評價方案 評價用體外診斷試劑行業標準《細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑盒（標準號YY∕T 1725-2020）》由項目組牽頭制定并發布，標準基于“34種細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑國家參考品（批號370026-201801）”，對相關試劑盒的要求、試驗方法及標簽和使用說明書等內容進行了規定[10-12]。
上述評價用國家參考品由項目組研制并提供，參考品由34種具有特定濃度（CFU/ml）的病原菌組成，包括12株革蘭陽性細菌（肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、單核細胞增多性李斯特菌、屎腸球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌、化膿鏈球菌、滕黃微球菌、馬紅球菌、格氏李斯特菌、緩癥鏈球菌）、16株革蘭陰性細菌（腦膜炎奈瑟菌、感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希氏菌、產酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、粘質沙雷氏菌、干燥奈瑟氏菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、瓊氏不動桿菌、副流感嗜血桿菌）及6株念珠菌（熱帶念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌）[10]。
1.2 病原菌多重核酸檢測試劑盒 進行分析性能質量評價研究的10款病原菌多重核酸檢測試劑盒由7家企業（廣州萬孚生物技術股份有限公司、蘇州創瀾生物科技有限公司、華大生物科技（武漢）有限公司、梅里埃診斷產品（上海）有限公司、湖南圣湘生物科技有限公司、百康芯（天津）生物科技有限公司、上海捷諾生物科技有限公司）提供，見表1。
表1 病原菌多重核酸檢測試劑盒?
注：*. 試劑盒A、E、F和G同時檢測病原菌和病毒；POCT. 即時檢驗。
1.3 分析性能質量評價 根據《細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑盒》行業標準和“34種細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑國家參考品”，按照試劑盒A～J說明書進行實驗操作：稀釋參考品至病原菌濃度≥1×105 CFU/ml后，對稀釋樣本檢測1次，評價試劑盒的陽性和陰性符合率進行評價；稀釋參考品至病原菌濃度≤檢出限濃度的5倍后，對稀釋樣本重復檢測10次，評價試劑盒的重復性；按10倍梯度稀釋參考品至病原菌濃度＜企業宣稱的檢出限濃度，對各梯度稀釋樣本檢測1次，評價試劑盒的檢出限。
1.4 評價標準及結果分析的評價標準 對于陽性和陰性符合率，試劑盒檢測范圍內的病原菌均應檢出且與已知種屬相符，不在檢測范圍內的均不應檢出；對于重復性，10次重復檢測結果，試劑盒檢測范圍內的病原菌均應檢出且與已知種屬相符；檢出限，檢測經10倍梯度稀釋的參考品，試劑盒檢測范圍內的病原菌，在檢出限濃度以上時均應檢出且與已知種屬相符。對檢出限評價結果進行統計及分類分析。
1.5 病原菌多重核酸檢測試劑盒基本情況 進行質量評價的10款試劑盒A～J，包括4款呼吸道感染試劑盒、3款中樞神經感染試劑盒及3款血流感染試劑盒。其中，6款試劑盒僅檢測病原菌，4款（1款呼吸道感染、3款中樞神經感染）試劑盒同時檢測病原菌和病毒；4款為全自動核酸即時檢驗（point-of-care testing, POCT），2款為半自動核酸POCT。上述試劑盒的技術原理，覆蓋目前常見的8種核酸檢測原理，包括熒光定量PCR、巢式PCR、擴增子拯救多重PCR、熔解曲線、恒溫擴增、微流控芯片、微陣列芯片及宏基因組高通量測序技術。各試劑盒具體信息見表1。
對于文中分析的10款試劑盒，其檢測范圍或病原菌譜既有重疊又各不相同。例如，呼吸道試劑盒、中樞神經試劑盒及血流試劑盒的病原譜均包含肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及大腸埃希氏菌等6種細菌；百日咳桿菌、嗜肺軍團菌、嗜麥芽窄食單胞菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎衣原體及煙曲霉等7種細菌和真菌僅出現在呼吸道感染試劑盒病原譜中；新生和格特隱球菌僅出現在中樞神經感染試劑盒病原譜中；化膿鏈球菌、近平滑念珠菌及克柔念珠菌等3種細菌和真菌僅出現在血流感染試劑盒病原譜中。各試劑盒具體病原菌譜見表2。
表2 多重核酸檢測試劑盒的病原菌譜?
注：*. 國家參考品中未覆蓋的病原菌；G+. 革蘭陽性細菌；G-. 革蘭陰性細菌；F. 真菌；MP. 肺炎支原體；CP. 肺炎衣原體；√. 該菌在病原菌譜中
02、結 果
使用參考品評價陽性和陰性符合率即重復性，結果表明病原菌濃度≥1×105 CFU/ml時，在試劑盒檢測范圍內的病原菌均能檢出并鑒定為正確的種屬，檢測范圍外病原菌均未檢出，表明試劑盒A～J具有較好的準確性和特異性；病原菌濃度≤檢出限濃度的5倍時，在試劑盒檢測范圍內的病原菌10次重復檢測均能檢出并鑒定為正確的種屬，表明試劑盒A～J具有較好的重復性。
使用參考品評價檢出限，試劑盒A～J檢測范圍內的病原菌的檢出限性能差異較大，從1 CFU/ml～8.5×105 CFU/ml，以下按照4種不同因素進行分類分析。
① 按呼吸道、中樞神經及血流3種感染類型分析試劑盒的病原菌譜檢出限性能，中位值（最小值，最大值）分別為5×103 CFU/ml（15 CFU/ml，5×104 CFU/ml）、1×103 CFU/ml（1 CFU/ml，6×103 CFU/ml）及1×106 CFU/ml（2×103 CFU/ml，8.5×107 CFU/ml）。
② 按革蘭陽性和陰性細菌及真菌3種病原菌種類分析，檢出限的中位值均為5×104 CFU/ml。
③ 分析病原菌譜中分布和出現頻率較高的6種菌的檢出限，肺炎鏈球菌為5×102 CFU/ml（15 CFU/ml，5×105 CFU/ml）、金黃色葡萄球菌為3×103 CFU/ml（5×102 CFU/ml，2.5×106 CFU/ml）、流感嗜血桿菌為1×103 CFU/ml（6×102 CFU/ml，1×106 CFU/ml）、銅綠假單胞菌為5×104 CFU/ml（1×102 CFU/ml，1×106 CFU/ml）、鮑曼不動桿菌為3×106 CFU/ml（5×102 CFU/ml，1×107 CFU/ml）及大腸埃希氏菌為5×104 CFU/ml（1 CFU/ml，3×107 CFU/ml）。
④按不同檢測原理分析，熒光定量PCR為1×103 CFU/ml（1 CFU/ml，6×103 CFU/ml）、巢式PCR為1×105 CFU/ml（1×102 CFU/ml，8.5×107 CFU/ml）、擴增子拯救多重PCR為2×106 CFU/ml（5×105 CFU/ml，5×106 CFU/ml）、恒溫擴增為5×104 CFU/ml（5×102 CFU/ml，5×104 CFU/ml）、高通量測序為5×102 CFU/ml（1×102 CFU/ml，5×102 CFU/ml）。試劑盒檢出限性能分析情況見圖1。
圖1 病原菌多重核酸檢測試劑盒檢出限性能的分析?
注：柱狀圖中間的短橫線表示檢出限的中位值，柱狀圖兩端分別表示檢出限的最大值和最小值。各試劑盒病的檢出限性能取log10值進行統計分析
03、討 論
自COVID-19疫情以來，分子診斷技術在臨床感染的診斷、療效及預后評估等領域得到越來越多的重視。病原菌引起的感染性疾病，特別是不明原因感染，給人類生命健康帶來嚴重威脅[17]。隨著分子診斷技術的發展及檢測成本的下降，特別是多重核酸檢測技術的應用日益廣泛，相比傳統病原菌檢測技術具有更好的時效性、準確性以及靈敏度，使得病原菌的快速精準診斷不斷的創新和發展。近年來，美國食品藥品監督管理局不僅批準了10余個病原菌多重核酸檢測試劑盒，更是先后制定并公布了4個相關指導原則用于規范此類試劑盒的質量[13-16]。本項目組于2018年，先后研制了“34種細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑國家參考品（批號370026-201801）”，并牽頭起草了《細菌和真菌感染多重核酸檢測試劑盒（標準號YY∕T 1725-2020）》體外診斷試劑行業標準，從實物標準和文字標準兩方面建立了較為全面的質量控制與評價體系，有助于促進我國相關行業的健康快速發展，以及保證相關試劑盒的質量[10-12]。
病原菌多重核酸檢測試劑盒的檢測原理及技術組合繁多。本研究中的10款試劑盒涵蓋了8種核酸檢測原理及7種技術組合（見表1），因此在產品設計開發、性能驗證及確認過程中需要嚴格的優化及測試，才能使各種技術的組合達到性能最優配置。一般而言，核酸擴增反應體系中引物和探針的數量越多，即檢測的病原菌數量越多，以及使用的技術組合越復雜，產品研發的難度越高[18]。例如，試劑盒F、G和J分別為單管檢測12種、14種和22種病原體，其產品研發的難度遠高于單管檢測10種以下病原體；試劑盒B為單管檢測7種病原體，但在一個熒光通道中分別使用熒光定量PCR和熔解曲線2種技術分別檢測2種病原體，因此其產品研發的難度也高于普通熒光定量PCR試劑盒；試劑盒C和D應用微流控技術，將多個單重反應體系疊加從而實現多重核酸檢測，但其使用的環介導恒溫擴增技術仍需注意檢出限和穩定性的優化，同時微流控芯片的大規模制造也需注意嚴格控制不良品率[19]。
病原菌多重核酸檢測試劑盒的操作復雜程度、檢測時間及成本控制各有不同，檢測的操作步驟一般分為樣本前處理、核酸提取純化或裂解、靶標基因核酸序列擴增、擴增子檢測及結果報告，不同試劑盒檢測流程的自動化、時間及成本也各不相同，是影響其臨床普及應用的重要因素。例如，為提高靈敏度和特異性所選擇的巢式PCR技術，不僅需要2輪PCR操作，更容易因其擴增子濃度極高而造成實驗室氣溶膠污染及假陽性結果；而基于微流控技術“樣本進、結果出”的全自動POCT試劑盒（試劑盒G～J），則能很好地避免污染（見表1），還具有操作容易、檢測時間較短等優勢，但其檢測成本要高于手工操作的PCR試劑盒。核酸提取過程較易實現自動化，但由于不同種類病原體（病毒和病原菌）的核酸提取難易程度不同，仍需進行優化及驗證，本研究中同時檢測病毒和病原菌的4款試劑盒（試劑盒A、E、F及G）中有2款未選擇自動化核酸提取流程（見表1）。試劑盒F的結果判讀過程為非自動化，需要檢測人員將陽性結果的Tm值與18個病原體的熔解曲線Tm值范圍逐一比對后進行判讀，不僅影響檢測時間，還容易導致檢測效率較低且易出錯。基于宏基因組高通量測序技術原理的試劑盒E，操作步驟繁瑣、所需測序時間較長且自動化程度低，相比PCR和恒溫擴增等試劑盒不僅有較長的檢測時間和較高的檢測成本，還可能由于復雜的手工操作導致檢測系統整體的穩定性受影響。
病原菌多重核酸檢測試劑盒的病原譜及檢出限性能與應用場景密切相關。呼吸道感染檢測試劑盒的病原菌譜，革蘭陰性菌占大多數，而中樞神經感染和血流感染檢測試劑盒的病原菌譜中，革蘭陰性和革蘭陽性菌的占比則差別不大（見表2）。由于病原菌在不同臨床感染樣本中的濃度不同，相應試劑盒的檢出限性能也不同。例如，腦脊液樣本一般比較干凈，因此中樞神經感染檢測試劑盒（試劑盒E～G）的檢出限較低，有助于更靈敏地檢測到病原菌；血培養陽性樣本中病原菌的濃度一般均較高，對試劑盒（試劑盒H～J）的檢出限要求不高，因此試劑盒在優化時可能會更側重提高特異性，即在反應體系中存在極高濃度核酸的情況下應避免發生非特異性擴增；呼吸道樣本中雜質較多且存在定植菌，因此相應試劑盒（試劑盒A～D）的檢出限處于前兩類試劑盒之間，通過設計較為均衡的檢出限，既能實現較好的檢測靈敏度，又有助于區分致病菌和定植菌。
本研究使用國家參考品在實驗室內對10款適用于呼吸道感染、中樞神經感染及血流感染臨床診斷且已經進入體外診斷試劑注冊階段的病原菌多重核酸檢測試劑盒的分析性能進行評價，并重點按照不同影響因素對其檢出限性能進行了深入分析。后續，相關試劑盒還將通過開展嚴格的臨床試驗來評價其臨床性能，從而最終驗證其性能能否滿足臨床使用需求。本研究提示，不同病原菌多重核酸檢測試劑盒的技術原理、靶標病原菌數量、自動化程度及操作復雜程度等各不相同；此外，適用于不同臨床應用場景的試劑盒，其病原菌譜的設計和檢出限性能的優化也各不相同。上述質量評價結果及分析有助于相關研發企業和醫療機構使用者深入了解我國病原菌多重核酸檢測試劑盒分析性能的現狀。
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來源：《傳染病信息》
