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近日，江蘇先聲醫療器械有限公司研發的“人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質譜法) ”獲批上市，下面嘉峪檢測網與您一起了解一下人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質譜法)在臨床前研發階段做了哪些實驗。

1、人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質譜法)的主要組成成分

產品主要組成成分見下表 

2、人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質譜法)的預期用途

本產品用于體外定性檢測人外周血樣本中的CYP2C19基因681位點 G>A、636 位點 G>A 和-806 位點 C>T 的多態性。 本產品用于氯吡格雷的用藥指導。本產品不能預測患者 對氯吡格雷的應答情況，僅能輔助醫生確定氯吡格雷治療策略。本產品檢測結果僅供臨床參考，不應作為患者是否用藥 的唯一依據，臨床醫生應結合患者病情、療效及其他實驗室檢測指標等對本產品的檢測結果進行綜合判斷。

3、人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質譜法)的檢驗原理

本試劑盒采用了多重PCR擴增技術、單堿基延伸技術 及飛行時間質譜檢測技術。根據所選擇的多態性位點設計多重PCR特異性擴增引物和延伸引物，PCR 擴增包含多態性 位點的基因序列，特異延伸引物在SNP位點上延伸1個堿基， 單堿基延伸產物經特定處理后與芯片基質共結晶，瞬時（10-9s) 強激光激發，基質將吸收的激光脈沖能量轉移給待 測樣本，在飛行時間質譜檢測系統中按質荷比加以分離。離子捕獲儀收集并儲存脈沖信號，自動對其進行質譜分析。在確定的分子量范圍（理論分子量±5Da）自動進行信噪比（SNR）值分析并通過SN 值的陽性判斷值來判斷待測樣本的基因型。

4、腹腔內窺鏡手術機器人的主要原材料

（1）主要原材料的選擇

本產品主要原材料包括：PCR Enzyme、10×PCR Buffer、 MgCl2，25mM、dNTP Mix、Shrimp Alkaline Phosphatase、SAP Buffer、iPLEX Pro Enzyme、Buffer Plus(10×)、384 Termination Mix、引物、質粒、gDNA。主要原材料均為外購，引物、質粒由開發人自行設計，由專業的合成公司合成。開發人制定了各主要原材料質量要求并經檢驗合格。

（2）企業參考品和質控品設置情況

開發人設計了完整的企業參考品，包括：8 份基因型參考品，4份陰性參考品，5份檢出限參考品，3份精密度參考品。 參考品采用臨床樣本和質粒樣本制備而成。

8份基因型參考品中7份來源于不同基因型的臨床樣本， 1份來源于質粒樣本。4份陰性參考品中1份來源于臨床樣 ，其余3份為各包含了 CYP2C19*7/10、CYP2C9*2、 CYP2C9*3 序列的混合質粒樣本。5 份檢出限參考品中 4 份來源于不同基因型的臨床樣本，1 份來源于質粒樣本。3 份精密度參考品均來源于不同基因型的臨床樣本。所有參考品 7 原材料均通過一代測序確認基因型。各項企業參考品綜合用于產品檢測準確性、精密度和檢出限的評價。

試劑盒包含1份陽性對照品和1份陰性對照品，用于檢測過程的質量控制。陰性對照品為人gDNA，陽性對照品為質粒，陽性對照品涵蓋該產品可檢出的3個代表性的突變類型，陰性對照品為野生型樣本。

5、腹腔內窺鏡手術機器人的生產工藝及反應體系研究

開發人通過功能性試驗確定最佳的生產工藝及反應體 系，包括：PCR 擴增反應體系中 PCR 引物、dNTP、PCR 酶的用量，PCR 退火溫度、PCR 循環數；酶解反應體系中 SAP 酶的用量，酶解時間；延伸反應體系中延伸引物、延伸終止 液、延伸反應酶的用量，延伸反應溫度、循環數。同時通過 臨床樣本確定了最優提取試劑盒、最佳 DNA 上樣量和 DNA 純度，確定了配套的樹脂芯片，確定了飛行時間質譜檢測系 統最佳的檢測參數，確定了最大檢測量及避免交叉污染的方式。

6、腹腔內窺鏡手術機器人的分析性能評估

本產品分析性能包括準確度、檢出限、檢測上限、精密度、分析特異性（干擾實驗、交叉反應）、適用的抗凝劑。 開發人開展了六批產品在適用機型上的性能評估。 采用 8 份基因型參考品，4 份陰性參考品，5 份檢出限參考品，3 份精密度參考品對本產品進行檢驗，結果均符合要求。 在準確度研究中，開發人采用本產品與 Sanger 測序進行比較研究試驗，使用至少三批試劑盒檢測 29 份不同濃度 （15-60ng/μL）的臨床樣本，臨床樣本包含野生型和所有多態性位點的雜合突變、純合突變。結果顯示兩種檢測方法的符合率為 100%，表明兩種方法具有較好的一致性。

在檢出限研究中，開發人使用至少三批試劑盒進行評估。采用 5 例臨床樣本，分別進行梯度稀釋，對系列濃度樣 本分別進行3次重復檢測，初步選擇15ng/μL和20ng/μL 作 為進一步研究的濃度。采用 5 例臨床樣本，分別稀釋至 15ng/ μL 和 20ng/μL ，對此濃度樣本分別進行 20 次重復檢測， 以陽性檢出率≥95%的最低基因組濃度作為檢出限，最終確定該產品檢出限濃度為15ng/μL。

在檢測上限評估中，開發人使用至少三批試劑盒進行評估。開發人從 62 例臨床樣本中選取濃度最高的 5 例臨床樣本分別進行 3 次重復檢測，檢測符合率為 100%的最高的兩個濃度梯度再分別進行 20 次重 復檢測。結果顯示上樣濃度高達 388ng/μL，申報試劑盒仍能準確檢出，未出現非特異的結果。

在精密度研究中，開發人采用 5 份臨床樣本分別稀釋為檢出限濃度和中濃度，分別評價了本產品批內、批間、檢測 輪次內（日內）、檢測輪次間（日間）、儀器、地點、操作者； 提取試劑盒批內、批間等連續 21 天的精密度，結果顯示檢 9 測結果符合率均為 100%。本產品批內、批間、日內、日間精密度，提取試劑盒批內、批間精密度以及不同操作者、不 同地點、不同儀器之間的精密度均較好，試劑性能穩定。

在干擾研究中，開發人使用至少三批試劑盒對各種可能的內源性及外源性干擾物質進行評價。結果顯示：血液樣本中可能存在的內源性干擾物質血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、 白蛋白濃度分別為 200g/L、37 mmol/L、342μmol/L、60g/L 時 對本試劑不產生干擾。外源性干擾物質 EDTA-Na2、 EDTA-K2、氯吡格雷、替格瑞洛、阿司匹林，濃度分別為 25 mmol/L、2.2mg/mL、300ng/mL、627ng/mL、300ng/mL 時對本試劑不產生干擾。

在交叉反應研究中，開發人使用至少三批試劑盒對臨床樣本、混合大腸桿菌 DNA 的臨床樣本、以及具有 CYP2C19 的其他突變序列、CYP2C9 基因序列等同源序列的多份混合 樣本進行檢測，檢測結果均與 Sanger 測序結果一致，符合率 100%。結果顯示檢測靶點之間不產生交叉反應，上述外源 DNA、同源序列與檢測靶點之間均不產生交叉反應。

在適用的抗凝劑研究中，開發人采用 27 份臨床樣本進 行三種抗凝劑采血管的適用性研究。結果顯示 EDTA 抗凝劑 采血管為最佳選擇。

7、腹腔內窺鏡手術機器人的陽性判斷值研究

開發人采用已知基因檢測結果的 99 份樣本通過 ROC 曲 10 線分析獲得陽性判斷值為 SNR≥5。之后采用 132 例臨床樣本 進行陽性判斷值適用性的驗證，結果顯示檢測結果與 Sanger 測序結果符合率為 100%。因此陽性判斷值設置合理。

8、腹腔內窺鏡手術機器人的穩定性研究

開發人使用三批試劑盒對本產品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的效期穩定性、開瓶穩定性、反復凍融穩定性、運輸穩定性、樣本穩定性進行了系統的研究，確定了在各種條件下試劑的有效保存時間，反復凍融次數，樣本保存溫度和時間。

效期穩定性：開發人采用三批次試劑儲存于-20±5℃條 件下，分別在 0、1、3、5、7、9、12、14 個月進行外觀檢 查、基因型參考品符合率、檢出限和精密度檢測，確定試劑 在-20±5℃條件下，可穩定保存 12 個月。

開瓶穩定性：開發人采用一批試劑在室溫下融化，試劑充分融化后，開蓋 10 min，然后蓋好試劑，-20±5℃條件下 儲存。分別在 0、1、2、3、4.5、5.5 和 6.5 個月的時間點取 出，進行外觀檢查、基因型參考品符合率、檢出限和精密度 檢測，確定試劑開瓶穩定性在-20±5℃條件下，可穩定保存 6 個月。

反復凍融穩定性：開發人采用一批試劑進行反復凍融， 分別在凍融次數 1、2、3、4、5、6 次時，進行外觀檢查、 基因型參考品符合率、檢出限和精密度檢測，確定試劑盒在 11 使用過程中可反復凍融 5 次。

運輸穩定性：開發人采用一批試劑進行不同路線冷鏈往 返運輸，最終確定試劑盒的運輸要求為采用保溫箱運輸（-20 ±5℃），運輸時間不超過 3.5 天。

樣本穩定性：開發人采用 20 份臨床樣本在-20±5℃下保 存 0、2、3、4.5、5.5、6.5 個月時，分別進行檢測；采用 4 份臨床樣本在 2~8℃下保存 0、2、4、7、9 天時，分別進行 檢測。檢測結果與 Sanger 測序結果進行比對，結果顯示樣本 在 2~8℃可保存一周，-20±5℃可保存 6 個月。