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嘉峪檢測網 2023-04-10 14:45
近日，廣州市達瑞生物技術股份有限公司研發(fā)的“二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）”獲批上市，下面嘉峪檢測網與您一起了解一下二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）在臨床前研發(fā)階段做了哪些實驗。
1、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的主要組成成分
產品主要組成成分見下表
2、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的預期用途
本產品用于定性檢測人外周全血樣本中人基因組 DNA 中 4 個遺傳性耳聾相關基因的 20 個突變位點，包括 GJB2 上 的 35 del G、176_191 del16、235 del C、299_300 del AT、 167delT，GJB3 上的 538C>T、547G>A，SLC26A4 上的 IVS7- 2A>G、2168A>G、281C>T、589G>A、1174A>T、1226G>A、 1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T， 和線粒體 12S rRNA 上的 m.1555A>G、m.1494C>T。 7 本產品用于遺傳性耳聾的輔助診斷。
本產品的檢測結果 僅代表對相關位點的檢測，不能作為患者是否有遺傳性耳聾 傾向的診斷和排除的唯一指標，檢測結果僅供臨床醫(yī)生參考， 如需確診病例，請結合臨床癥狀及其他檢測手段綜合進行評 估，檢測結果不得作為臨床診治的唯一標準。
3、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的檢驗原理
根據所選擇的多態(tài)性位點設計多重 PCR 特異性擴增引物和延伸引物，PCR 反應擴增包含多態(tài)性位點的基因序列， 特異延伸引物在 SNP 位點上延伸 1 個堿基，樣本經特定處理 后與芯片基質共結晶，瞬時納秒（10-9 s) 強激光激發(fā)，基質將 吸收的激光脈沖能量轉移給待分析樣本，按質荷比加以分離。 離子捕獲儀收集并儲存脈沖信號，并對其進行質譜分析，通 過比較 A、T、G 和 C 的信號強度及毗鄰信號間質量的差異 （ ddATP=271.2Da ， ddCTP=247.2Da ， ddGTP=287.2Da ， ddTTP=327.1Da) 可得出模板序列的信息。
4、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的主要原材料研究
4.1 主要原材料的選擇
本產品在制備過程中主要原材料包括檢測試劑中的多重 PCR 緩沖液、氯化鎂緩沖液、dNTP 混合物、PCR 引物、 8 多重 PCR 酶、磷酸酶緩沖液、磷酸消化酶、延伸緩沖液、延 伸引物、延伸終止混合液、反應催化酶、D20 陽性質控品、 D20 多位點陽性質控品、D20 陰性質控品；芯片試劑中的脫 鹽樹脂和質譜芯片等。
主要原材料中 D20 陽性質控品為含 GJB2：235delC 突變 雜合體的基因組 DNA；D20 多位點陽性質控品為含 GJB2： 176_191del16 突變、GJB3：538C>T 突變、SLC26A4：2168A>G 突變、12S rRNA：m.1555A>G 突變位點的質粒，由開發(fā)人設計后由專業(yè)的合成公司合成；D20 陰性質控品為本試劑盒檢 測范圍內 20 個位點野生型的基因組 DNA；PCR 引物、延伸 引物為開發(fā)人自行設計后由專業(yè)的合成公司合成；其余主要 原材料均為外購方式獲得。
開發(fā)人選擇有資質的供應商提供原料，通過功能性試驗篩選出最佳原材料和供應商，制定了 各主要原材料質量要求并經檢驗合格。
4.2 企業(yè)參考品和質控品設置情況
企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考 品和重復性參考品。
陽性參考品共 23 份，涵蓋該產品可檢出的所有突變類型。其中，17 份由對應的型別突變的全血基因組 DNA 制備而成，6 份由對應的突變型質粒 DNA 和野生型人類基因組 DNA 按拷貝數混合制備而成；陰性參考品 10 份，其中 3 例 9 由試劑盒檢測范圍內 20 個位點野生型全血樣本基因組 DNA 制備而成，4 例由地貧突變位點全血樣本基因組 DNA 制備而 成，3 例由試劑盒檢測范圍外的人耳聾基因突變全血樣本基 因組 DNA 制備而成；最低檢測限參考品 23 份，涵蓋該產品 可檢出的所有突變類型。其中，15 份由對應的型別突變的全血基因組 DNA 制備而成，2 份由野生型人基因組 DNA 和相 應型別突變全血基因組 DNA 制備而成，6 份由對應的突變型 質粒 DNA 和野生型人類基因組 DNA 按拷貝數 1:1 混合制備 而成；重復性參考品 3 份，由對應的型別突變的全血基因組 DNA 制備而成。
試劑盒包含 2 份陽性質控品和 1 份陰性質控品，用于檢測過程的質量控制。其中，D20 陽性質控品由一定濃度的 GJB2：235delC 雜合型基因組 DNA 組成，D20 多位點陽性質控品由重組質粒組成，陰性質控品由試劑盒檢測范圍內 20 個位點野生型的基因組 DNA 制備而成。
5、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的生產工藝和反應體系研究
開發(fā)人對試劑盒反應體系的研究中包括：多重 PCR 酶用 量的優(yōu)化、PCR 擴增條件優(yōu)化、多重 PCR 引物濃度、優(yōu)化磷酸消化酶的用量和反應時長、延伸反應中酶的用量優(yōu)化、優(yōu)化延伸引物的用量、延伸終止混合液用量的優(yōu)化、延伸反應 循環(huán)數的優(yōu)化、脫鹽樹脂用量的優(yōu)化、樣品點樣體積的優(yōu)化、 10 激光脈沖次數的優(yōu)化、樣本類型、樣本采集、保存及運輸、 核酸模板用量初步研究、質控體系的建立、實驗結果的判定 標準研究。
通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。開發(fā)人根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定 了最佳的生產工藝。
6、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的分析性能評估
本產品分析性能包括準確性、精密度、重復性、分析 特異性、抗干擾以及核酸提取試劑的性能評估。
6.1 準確性研究
陰陽性參考品符合率評估中，分別使用三個批次的試劑盒對企業(yè)陰/陽性參考品在適用機型上進行檢測，檢測結果為陽性符合率 100%、陰性符合率 100%。
6.2.精密度
在運行間、日間、人員間、儀器間和批間精密度符合 率評估中，開發(fā)人在適用機型上使用連續(xù)生產的三批試劑盒對外周血樣本（已涵蓋不同基因的不同突變類型）進行檢測，檢測結果的分子量的 ANOVA 方差分析的顯著性 P 均大于 0.05 且均為相應型別，符合率均為 100%。 重復性評估中，開發(fā)人在適用機型上使用連續(xù)生產的三批試劑盒對稀釋到檢測限濃度的 3 份重復性參考品進行 重復檢測 10 次，檢測結果表明重復性和批間差均滿足技術要求規(guī)定的性能指標要求。 臨床樣本精密度評估中，開發(fā)人在適用機型上使用連續(xù)生產的三批試劑盒對外周血進行重復檢測 3 次，三個批 次試劑盒對樣本進行重復三次的檢測結果均為相應型別， 結果符合率 100%。 最低檢出限濃度水平的精密度評估中，開發(fā)人在適用 機型 DR MassARRAY 上使用連續(xù)生產的三批試劑盒對稀釋 至最低檢測限濃度水平的外周血進行重復檢測 3 次，三個批次試劑盒對樣本進行重復三次的檢測結果均為相應型別，結果符合率 100%。
6.3 分析特異性
開發(fā)人使用試劑盒對分別加入了不同梯度潛在干擾物質（膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白、鏈霉素和阿米卡星） 的外周全血（原濃度及稀釋至最低檢測限濃度水平濃度） 提取的 DNA 在適配機型上進行檢測。結果顯示當樣本中膽 紅素濃度≤0.32mg/mL、甘油三酯體積比≤5%、血紅蛋白濃 12 度≤18mg/mL 和鏈霉素濃度≤15g/mL 和阿米卡星濃度 ≤15μg/mL 的范圍內時，均不干擾本試劑盒的檢測結果，且不影響試劑盒對最低 DNA 濃度（2.5ng/µL）樣本的檢測結 。
在靶突變最低檢出限濃度水平樣本的干擾研究評估 中，開發(fā)人使用連續(xù)生產的三批試劑盒對稀釋至最低檢測 限濃度水平的含不同潛在干擾物質（膽紅素、甘油三酯、 血紅蛋白、鏈霉素和阿米卡星）的樣本進行重復檢測 3 次，本試劑盒可以準確地檢測出樣本的相應類型，說明外 周全血樣本膽紅素濃度≤0.32mg/mL、甘油三酯體積比 ≤5%、血紅蛋白濃度≤18mg/mL、鏈霉素濃度≤15g/mL 和阿米卡星≤15μg/mL 范圍內時，不影響試劑盒對最低 DNA 濃 度（2.5ng/µL）樣本的檢測結果。
GJB3 基因突變樣本的干擾評估中，開發(fā)人使用試劑盒 對分別加入了不同梯度潛在干擾物質（膽紅素、甘油三 酯、血紅蛋白、鏈霉素和阿米卡星）的干擾樣本（檢測試 劑盒范圍內 2 例 GJB3 耳聾基因突變陽性外周全血樣本） 在適配機型 DR MassARRAY 上進行檢測。結果顯示當樣本 中膽紅素濃度≤0.32mg/mL、甘油三酯體積比≤5%、血紅蛋白濃度≤18mg/mL 和鏈霉素濃度≤15g/mL 和阿米卡星濃度 13 ≤15μg/mL 的范圍內時，對該試劑盒 GJB3：538C>T 突變 雜合體和 GJB3：547G>A 突變雜合體檢測不造成干擾。
6.4 最低檢出限
最低檢測限評估中，開發(fā)人設置了 3 個濃度梯度的人 基因組 DNA，并對每個濃度的 DNA 樣本進行重復檢測 10 次，將具有 100%檢出率的最低濃度設定為檢測限。 在檢測限測定評估中，開發(fā)人使用連續(xù)生產的三批試 劑盒對稀釋至最低檢測限濃度水平的 23 份檢測限參考品進行檢測，檢測結果顯示檢測限參考品符合率為 100%。 兩種樣本類型檢測限評估中，開發(fā)人使用連續(xù)生產的 三批試劑盒對稀釋至最低檢測限濃度水平的外周血（包含 試劑盒檢測范圍外突變樣本和其他遺傳性疾病樣本）進行檢測，檢測結果顯示均為相應型別，結果符合率為 100%。
6.5 提取試劑盒性能研究
針對核酸提取試劑性能研究，開發(fā)人采用臨床樣本平行比較了不同廠家核酸提取或純化試劑的提取性能，通過對 比提取所得 DNA 的濃度和檢測結果，最終確定廣州市達瑞 14 生物技術股份有限公司的核酸提取或純化試劑可以為該產 品的配套提取試劑。
6.6.其他性能研究
6.6.1 環(huán)境污染產生的可能性研究
為了驗證試劑盒對環(huán)境產生污染的可能性，開發(fā)人在 擴增室的五點處放置裝有高壓滅菌純化水的培養(yǎng)皿，在第三天將所有培養(yǎng)皿中的水用提取試劑進行核酸提取，并使用連續(xù)生產的三批試劑盒進行檢測，實驗研究表明本試劑盒不會造成環(huán)境污染。
6.6.2 相鄰峰檢測結果的研究
相鄰峰檢測結果驗證評估中，開發(fā)人使用連續(xù)生產的三批試劑盒對 GJB2：235delC 及 SLC26A4：IVS7-2A>G 突 變復合雜合體樣本和 SLC26A4：IVS7-2A>G 野生型樣本進 行檢測，檢測結果發(fā)現對于峰位較近的位點，一個峰較高 時對臨近峰的結果判定是沒有影響的。
6.6.3 不同靶板（芯片）孔間交叉污染研究
不同靶板（芯片）孔間交叉污染評估中，開發(fā)人在一 個陰性質控周圍設置了陽性質控，并使用連續(xù)生產的三批 15 試劑盒進行檢測，檢測結果顯示均為相應型別，不同靶板 （芯片）孔間不會造成檢測結果交叉污染。
7、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的陽性判斷值的確定
對于 20 個突變位點（GJB2 上的 35 del G、176_191 del16、 235 del C、299_300 del AT、167delT，GJB3 上的 538C>T、 547G>A，SLC26A4 上的 IVS7-2A>G、2168A>G、281C>T、 589G>A、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、 1975G>C、2027T>A、2162C>T，和線粒體 12S rRNA 上的 m.1555A>G、m.1494C>T），開發(fā)人使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，簡稱 ROC 曲線） 通過已知檢測結果的臨床樣本確定陽性判斷值。當 20 個位 點的野生型及突變型中至少一個峰的峰高≥2 時，SNR≥3 時， 則認為結果可靠，可進行下一步判定：根據突變型峰值∕野生 型峰值進行判定，如果峰高比＞3 則判定為純合突變（野生 型峰值為 0 時，其峰高比接近無窮大，也符合該判定），如果 0.5≤峰高比≤3，則判讀為雜合突變，其他情況（也就是如 果＜0.5），則判讀為野生型。
為驗證陽性判斷值，開發(fā)人使用試劑盒對已知檢測結果的臨床樣本進行檢測。檢測結果表明建立的陽性判斷值能準確判斷檢測范圍內的 20 個突變位點的突變狀態(tài)。
8、二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒 （飛行時間質譜法）的穩(wěn)定性研究
開發(fā)人對本產品的實時穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn) 定性、運輸穩(wěn)定性以及樣本穩(wěn)定性進行了研究，確定了在 各種條件下本產品及樣本的有效保存時間。
研究結果表明：檢測試劑盒儲存于-20±5℃；芯片試劑 盒儲存于室溫 15～30℃；本試劑盒在以上所述儲存條件下的有效期為 9 個月。
本試劑盒允許開瓶 12 次，開瓶 12 次后可以保存 8 個 月；反復凍融次數不超過 12 次，反復凍融 12 次后可保存 6 個月；在儲存溫度下，運輸時間不應超過 10 天。
樣本穩(wěn)定性研究表明，EDTA 抗凝管采集的外周全血樣本置于 2~8℃保存時可以保存 60 天，在-20±5℃保存時可以 保存 6 年，凍融次數不超過 4 次。外周全血提取的 DNA 樣 本置于-20±5℃可以保存 6 個月。
來源：嘉峪檢測網
