近期，華南理工大學(xué)董華教授團(tuán)隊(duì)在科愛的期刊Bioactive Materials上發(fā)表研究論文：一種新型的載胰島細(xì)胞的抗粘附核殼微凝膠和體內(nèi)預(yù)血管化水凝膠支架組成的生物人工胰腺。該研究構(gòu)建的生物人工胰腺結(jié)合了胰島微封裝和宏封裝策略，維持了皮下移植后胰島的長期活性和胰島素分泌功能，實(shí)現(xiàn)了糖尿病小鼠長達(dá)90天的血糖調(diào)控。
研究內(nèi)容簡介
1型糖尿病（T1DM）是一種因天然胰腺中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞被破壞而引起的自身免疫性疾病。除了持續(xù)高血糖和內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂外，1型糖尿病患者還經(jīng)常伴有心肌梗死、視網(wǎng)膜病變、腎病、神經(jīng)病變等多種并發(fā)癥。雖然外源性胰島素注射可以在一定程度上緩解這些癥狀，但仍然無法阻止終末期器官并發(fā)癥的進(jìn)一步惡化，致使許多患者在中青年時(shí)期就有很高的并發(fā)癥發(fā)病率和死亡率。此外，1型糖尿病患者還存在所謂的“脆性T1DM”，即在短時(shí)間內(nèi)具有不可預(yù)測的血糖振蕩，如突發(fā)的高血糖，隨后又嚴(yán)重低血糖。如治療不當(dāng)或不及時(shí)，隨時(shí)都可能演變成驚厥、昏迷甚至死亡。
胰島移植通過植入供者的胰島細(xì)胞、多能干細(xì)胞分化的胰島細(xì)胞或基因編輯的動(dòng)物胰島細(xì)胞來替代患者體內(nèi)功能受損的胰島，繼而重建內(nèi)源性胰島素分泌，實(shí)現(xiàn)外源胰島素獨(dú)立，有望發(fā)展成為一種理想的1型糖尿病治療方案。然而，嚴(yán)重的宿主免疫排斥反應(yīng)以及缺乏血管網(wǎng)絡(luò)而造成的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足往往會(huì)導(dǎo)致移植失敗，限制了胰島移植在臨床上的廣泛應(yīng)用。
圖1：皮下移植生物人工胰腺用于治療1型糖尿病
本工作結(jié)合胰島微封裝和宏封裝策略制備了一種新型的生物人工胰腺用于胰島移植。其中，抗粘附的核殼微凝膠為胰島細(xì)胞提供了類細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境和免疫保護(hù)，而體內(nèi)預(yù)血管化支架誘導(dǎo)的血管網(wǎng)絡(luò)為胰島提供氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)。將預(yù)血管化的水凝膠支架和載胰島的核殼微凝膠結(jié)合形成生物人工胰腺，移植到糖尿病小鼠皮下用于血糖調(diào)節(jié)（圖1）。
圖2：GelMA/HepMA/VEGF水凝膠支架的制備和表征:（a）GelMA/HepMA/VEGF水凝膠支架的制備流程及水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)示意圖;（b）制造過程中的實(shí)物照片;（c）水凝膠支架中肝素的甲苯胺藍(lán)染色;（d）水凝膠支架中的VEGF釋放行為;（e）內(nèi)皮細(xì)胞在水凝膠表面的增殖。
皮下胰島移植具有便于植入、監(jiān)測和回收，移植位點(diǎn)多，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)勢，在臨床上非常具有吸引力。然而，皮下血管密度低，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，是皮下胰島移植面臨的最大難題。為解決這一難題，研究者們首先設(shè)計(jì)了一種水凝膠支架用于誘導(dǎo)皮下血管化（圖2）。利用甲基丙烯酸酯化明膠（GelMA）的冷凝及與甲基丙烯酸酯化肝素（HepMA）的共價(jià)交聯(lián)在生物醫(yī)用硅膠管表面形成水凝膠涂層，而后利用HepMA與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的相互作用得到一種GelMA/HepMA/VEGF水凝膠支架。通過對(duì)水凝膠支架中的肝素進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色表明，與GelMA的共價(jià)偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)了HepMA在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的固定。同時(shí)HepMA能與VEGF特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了VEGF從水凝膠支架中的緩釋。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）接種到水凝膠表面培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，GelMA/HepMA/VEGF水凝膠支持HUVECs的粘附和增殖。
圖3：GelMA/HepMA/VEGF水凝膠支架的體外和體內(nèi)血管生成:（a）通過體外transwell遷移試驗(yàn)評(píng)估水凝膠支架對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的募集能力;（b）皮下植入15天后的硅膠管和水凝膠支架的照片;（c）回收的硅膠管和水凝膠支架的H&E染色;（d）回收的硅膠管和水凝膠支架的CD31免疫組織化染色;（e）硅膠管和水凝膠支架皮下植入15天后誘導(dǎo)的血管密度。
采用transwell遷移試驗(yàn)評(píng)估了水凝膠支架對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的募集能力，發(fā)現(xiàn)GelMA/HepMA/VEGF組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯大于對(duì)照組，說明負(fù)載VEGF的水凝膠支架能顯著促進(jìn)HUVECs的遷移。將水凝膠支架移植到皮下15天后發(fā)現(xiàn)，支架仍然保持著良好的形狀，在支架周圍觀察到了大量的新生血管。H&E和CD31染色結(jié)果進(jìn)一步展示了GelMA/HepMA/VEGF水凝膠支架周圍高密度的血管，說明水凝膠支架中緩釋的VEGF可以招募內(nèi)皮細(xì)胞形成血管網(wǎng)絡(luò)，從而為后期移植的胰島提供氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)（圖3）。
圖4：核殼微凝膠的制備和表征:（a）利用單核微凝膠制備核殼微凝膠的示意圖;（b）不同核殼材料制備的核殼微凝膠的明場和熒光圖像;（c）多層核殼微凝膠圖像及其粒徑統(tǒng)計(jì)（從左至右：單核微凝膠、核殼微凝膠、雙殼層微凝膠）。
接著，利用微流控技術(shù)制備了單核的微凝膠，并通過浸泡法負(fù)載光引發(fā)劑。而后將微凝膠轉(zhuǎn)移到含有雙鍵的水凝膠前體溶液中，引發(fā)劑從單核微凝膠向外擴(kuò)散，光引發(fā)使水凝膠前體溶液在微凝膠表面聚合，實(shí)現(xiàn)功能性殼層的構(gòu)建，最終得到了核殼結(jié)構(gòu)的微凝膠（圖4）。通過更換不同的核殼材料，以及構(gòu)建不同殼層數(shù)量的核殼微凝膠，驗(yàn)證了該方法用于制備核殼微凝膠的可行性和普適性。
圖5：核殼微凝膠的抗蛋白和細(xì)胞粘附性能:（a）熒光蛋白在不同塊狀水凝膠表面的吸附;（b）不同塊狀水凝膠的溶脹性能;（c）不同塊狀水凝膠的孔隙率;（d）熒光蛋白在微凝膠表面的粘附;（e）巨噬細(xì)胞在微凝膠表面的粘附。
移植物表面的非特異性蛋白和細(xì)胞吸附被認(rèn)為是觸發(fā)免疫排斥和異物反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，因此構(gòu)建抗粘附的胰島封裝材料十分重要。通過構(gòu)建抗粘附的微凝膠外殼，可以降低胰島移植引起的免疫排斥反應(yīng)，在無需抗免疫排斥藥物的情況下實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，從而延長胰島在體內(nèi)的存活和功能。在這里，我們制備了一種PEGDA/CBMA（縮寫為P/C）兩性離子水凝膠，發(fā)現(xiàn)兩性離子能夠降低水凝膠表面的蛋白吸附，且在CBMA含量為10 wt%時(shí)達(dá)到了最好的抗粘附效果（圖5）。同時(shí)，對(duì)核殼微凝膠表面的蛋白和細(xì)胞粘附測試發(fā)現(xiàn)，蛋白和細(xì)胞在HAMA@P/C(10)微凝膠表面同樣吸附很少，說明兩性離子的水凝膠外殼賦予了微凝膠優(yōu)異的抗吸附性能。
圖6：負(fù)載胰島細(xì)胞的HAMA@P/C(10)核殼微凝膠的體外生物學(xué)表征:（a）通過活/死染色測試胰島細(xì)胞活性;（b）葡萄糖刺激的胰島素分泌試驗(yàn);（c，d）巨噬細(xì)胞與負(fù)載胰島的HAMA@P/C(10)微凝膠共培養(yǎng)后產(chǎn)生的（c）ROS水平和（d）TNF-α水平。
通過活/死染色和葡萄糖的刺激胰島素分泌（GSIS）試驗(yàn)評(píng)估了裸胰島和微凝膠封裝胰島的體外活性和胰島素分泌功能（圖6）。活/死染色結(jié)果顯示裸胰島、單核微凝膠封裝胰島和核殼微凝膠封裝胰島的活性相當(dāng)，均沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，表明微凝膠封裝過程，包括微流控封裝和表面殼層構(gòu)建，對(duì)胰島活性基本沒有影響。另外，GSIS試驗(yàn)結(jié)果顯示，裸胰島和封裝的胰島都能對(duì)葡萄糖濃度的改變產(chǎn)生響應(yīng)（胰島素分泌量的改變），各組之間的刺激指數(shù)沒有顯著差異，表明胰島素分泌功能同樣不受封裝過程的影響。將負(fù)載胰島的HAMA@P/C(10)核殼微凝膠與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)后，測試巨噬細(xì)胞表達(dá)的ROS水平及分泌的TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)核殼微凝膠能顯著降低胰島細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。因此，核殼微凝膠既能為胰島提供類細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境及免疫隔離，同時(shí)又降低了外源胰島細(xì)胞引起的免疫排斥反應(yīng)。
圖7：將生物人工胰腺移植到STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠皮下動(dòng)物實(shí)驗(yàn):（a）胰島移植過程示意圖;（b）移植后的小鼠血糖水平;（c）腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）;（d）移植90天后取回的生物人工胰腺的H&E染色,（e）CD31免疫組織化學(xué)染色和（f）胰島素免疫熒光染色。
最后，通過腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建了1型糖尿病小鼠模型，同時(shí)將預(yù)血管化支架移植到小鼠皮下（圖7）。15天后，取出硅膠管并將負(fù)載胰島的HAMA@P/C(10)核殼微凝膠注射到支架的空腔中，構(gòu)成生物人工胰腺用于糖尿病治療。胰島移植后，糖尿病小鼠的血糖水平快速降低，且維持正常血糖水平（<200 mg dL−1）長達(dá)90天。相反，直接皮下注射負(fù)載胰島的HAMA@P/C（10）微凝膠只能引起血糖水平的小幅下跌，而后迅速反彈回原來的高血糖水平，說明了預(yù)血管化支架誘導(dǎo)的血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)維持胰島活性和功能的重要作用。與生物人工胰腺組相比，將裸胰島移植到預(yù)血管支架中可以實(shí)現(xiàn)短暫的血糖正常（1-3天），然后又恢復(fù)到高血糖狀態(tài)，說明免疫系統(tǒng)的攻擊導(dǎo)致了胰島凋亡。為了證明這一假設(shè)，將載有胰島的HAMA微凝膠也移植到預(yù)血管化支架中，可以發(fā)現(xiàn)更長時(shí)間的正常血糖水平（約36–42天）。顯然，抗粘附核殼微凝膠可以實(shí)現(xiàn)最佳的免疫保護(hù)。而將裸胰島直接移植到皮下后，由于同時(shí)缺乏血管網(wǎng)絡(luò)和微凝膠的免疫保護(hù)，呈現(xiàn)出最差的糖尿病治療效果。
對(duì)移植達(dá)到90天的生物人工胰腺進(jìn)行回收，發(fā)現(xiàn)小鼠血糖迅速升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了生物人工胰腺在小鼠體內(nèi)的長期血糖調(diào)節(jié)能力。同時(shí)，H&E和CD31染色結(jié)果再次表明，預(yù)血管化支架能在皮下誘導(dǎo)形成豐富的血管網(wǎng)絡(luò)，且新生血管緊靠在移植物周圍，從而高效地為移植的胰島提供氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)。更重要的是，微凝膠表面在90天后仍然保持清潔，沒有明顯的巨噬細(xì)胞沉積和纖維囊形成，說明核殼微凝膠體內(nèi)優(yōu)異的抗異物反應(yīng)能力。此外，在胰島素免疫熒光染色結(jié)果中觀察到胰島素陽性，表明生物人工胰腺中的胰島在移植90天后仍保持正常的胰島素分泌功能。
綜上所述，我們開發(fā)了一種結(jié)合胰島宏封裝和微封裝策略的生物人工胰腺用于胰島移植。其中，預(yù)血管化支架能有效地促進(jìn)血管生成，改善皮下血管缺乏的問題，為胰島提供充足的氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)。同時(shí)，類細(xì)胞外基質(zhì)的微凝膠為胰島提供了適宜的微環(huán)境，且兩性離子的外殼賦予了微凝膠優(yōu)異的抗粘附性，能明顯降低外源性胰島細(xì)胞引起的免疫炎癥反應(yīng)，為胰島提供免疫保護(hù)。兩者的結(jié)合增強(qiáng)了移植后胰島的存活和功能，在1型糖尿病小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了長達(dá)90天的血糖調(diào)節(jié)。我們相信這種生物人工胰腺為1型糖尿病的治療提供了一種新的解決方案，相關(guān)制備策略也能應(yīng)用于其他細(xì)胞療法。
原文信息
Haofei Li, Yulian Shang, Qi Feng, Yang Liu, Junlin Chen, Hua Dong*.
A novel bioartificial pancreas fabricated via islets microencapsulation in anti-adhesive core-shell microgels and macroencapsulation in a hydrogel scaffold prevascularized in vivo.
Bioactive Materials, 27 (2023) 362-376.
