近期，美國寺崎生物醫學創新研究所的Ali Khademhosseini研究團隊在科愛創辦的期刊Bioactive Materials上發表文章: 肝素是一種帶負電荷的多糖，具有不同的鏈長和親水性骨架。肝素因其獨特的化學和物理性質、無毒、生物相容性和生物可降解性而被廣泛應用于心血管和血液學等醫學領域。這篇綜述著重介紹了基于肝素的各種生物醫學應用材料設計的近期和未來進展。討論了肝素的物理化學和機械性能、生物相容性、毒性和生物降解性。此外，對肝素類材料在藥物/基因傳遞、組織工程、癌癥治療、生物傳感器等生物醫學領域的應用進行了綜述。最后，總結了肝素材料制備的挑戰、機遇和未來的前景。
引言
肝素是由兩個重復的二糖組成的糖胺聚糖(GAG)；1，4-連接的糖醛酸(D-葡萄糖醛酸(GLCA)或L-艾杜糖酸(IDOA))和D-氨基葡萄糖(GLCN)。肝素是一種線性多糖，由于其結構中含有羧基和磺酸基，因此具有很高的負電荷。體內肝素的生物合成由內質網和結締組織中肥大細胞的高爾基體，包括腸、肝和肺，通過激活幾種酶反應。
肝素的質量和應用主要受肝素相對分子質量的控制。與低分子肝素相比，高分子肝素在水中的溶解和降解速度更慢，因此適合于持續給藥或低降解應用。普通肝素(UFH)、低分子肝素(LMWH)和超低分子肝素(ULMWH)是商業上可用的肝素的三個亞類。UFH是純化后從動物組織中采用的加工最少的肝素形式。LMWH是通過控制UFH的解聚而產生的，ULMWH是一種化學合成的肝素形式，具有與UFH和LWMH相同的五糖序列。
隨著最近納米技術的進步，以及在藥物輸送和再生醫學中使用納米技術取得的成就，研究人員在研究中越來越多地使用了納米技術。因此，幾種不同尺寸、形態和結構特征的納米材料已被引入并用于治療應用。利用這些納米平臺可以通過提高治療劑在其目標部位的生物利用度并減少其副作用來提高治療效果。肝素是一種可以融入到納米材料結構中的激動劑。例如，肝素可以作為納米載體的包衣劑，并提供一個連接抗炎劑的平臺。另一方面，肝素可以與不同類型的細胞因子和趨化因子結合，抑制核轉錄因子-κB(NF-κB)途徑的激活，從而增強細胞因子和趨化因子的抗炎反應。此外，肝素衍生物還可以作為抗癌劑，通過選擇性結合促血管生成因子和抑制肝素酶來抑制腫瘤轉移和血管生成。
圖1 (A)肝素的化學和(B)三維結構。結合核磁共振波譜和分子模擬方法，描述了肝素的三維結構(球棒模型)。在一個模型中，所有的2-O-磺酸-α-L-艾杜糖醛酸都是2S0構象(I和II)，而在另一個模型中(III和IV)，它們都是1C4構象。
圖2 細胞內肝素和硫酸肝素的生物合成以及高爾基體和內質網通過幾種酶反應的成熟。(A)核心蛋白首先在內質網中產生。然后一步一步地將四糖連接物連接到蛋白質的絲氨酸殘基上，然后聚合多糖鏈。木糖，半乳糖，絲氨酸，NA：亞硫化結構域，NS：高硫化結構域。Ext：Exostosin；Exostosin-1和Exostosin-2分別是人類EXT1和Ext2基因所表達的蛋白質。抗凝血酶III是一種小的糖蛋白抗凝劑，可使凝血系統的幾種酶失活。(B)硫酸乙酰肝素蛋白多糖在細胞外基質中轉移或附著在質膜上以發揮其生物學功能。
圖3 合成肝素/硫酸肝素鍵的示意圖，以及肝素酶如何用于釋放生長激素。(A)活躍的生長因子釋放機制是由于在肝素酶/肝素酶存在的情況下肝素/肝素硫酸酯鍵被破壞而發生的。(B)乙酰肝素酶作用前后含有納米膠囊的肝素的原子力顯微鏡圖像。
圖4 肝素抗凝活性示意圖。肝素和抗凝血酶 (AT)-III 之間的相互作用導致 AT-III 結構發生構象變化，使其適合附著于凝血因子并抑制凝血途徑。
圖5 在支架結構中使用肝素以提高血管化率。(A) 多孔 HA/(COL/HEP)5 支架的 SEM 圖像。(B) 支架內間充質干細胞分布的共焦顯微圖像。(C) 植入物周圍血管形成率的差異取決于肝素的存在和不存在。(D) 暴露不同成分的組織切片 7、14 和 28 天后形成的新血管數量。
圖6 肝素負載PCL-α纖維膜的合成及其抗凝和血液相容性研究。(A) 用于骨缺損的負載肝素的 PCL-α-TCP 纖維膜的示意圖。(B) 肝素對抗肺部 COVID-19 炎癥的抗炎機制。肝素可以通過阻止 IL-6 功能并抑制炎癥細胞浸潤，作為抗擊 COVID-19 的抗炎劑。
圖7 不同的肝素化策略——物理混合、逐層包衣、直接/間接化學結合。在物理混合中，肝素被混合到本體基質中并通過范德華力或靜電相互作用（左上）相互作用。逐層涂層主要涉及靜電相互作用，與其他帶正電的材料形成聚電解質復合物（右上）。在化學綴合策略中，肝素直接（左下）或通過連接分子（右下）共價連接到本體基質。
圖8 用于心臟組織再生的醛修飾HA、乙二醇殼聚糖和PEDOT復合導電水凝膠的合成。(A) 導電復合材料 HA-ALD/GC/PEDOT 的制備。(B) 使用電路描繪的水凝膠的自愈特性。(C) 導電水凝膠的粘合性能。(i) 水凝膠與雞心有效粘附。即使在（ii）用水沖洗或（iii）浸入水中后，水凝膠仍保持粘附。(D) 在水凝膠中培養 7 天后 C2C12 細胞活/死染色后的代表性圖像（比例：200 μm）。(E) 用肌鈣蛋白 T 免疫染色的 C2C12 細胞的代表性圖像（綠色），表明誘導肌生成（比例：100 μm）。細胞核用 DAPI 染色。
圖9 涂有明膠、PLL 和肝素的氨解聚-ε-己內酯電紡支架，用于血管組織工程。(A) 用明膠、PLL 和肝素逐層涂覆電紡 PCL 支架以形成納米涂層的制備示意圖。然后支架與 Genepin 交聯，并進一步用于細胞培養應用，其中肝素以 MMP2 依賴性方式釋放。(B) 第 5 天時 HUVEC 的代表性熒光顯微照片（比例：40 μm）。肌動蛋白細胞骨架用熒光紅鬼筆環肽染色，而細胞核用 DAPI 染色。(C) 不同支架上血小板粘附的定量。(D) 不同支架的貧血小板血漿的 APTT 凝固時間。
圖10 用于血管組織工程的肝素接枝聚(酯-氨基甲酸酯)脲/明膠電紡管狀支架的合成。(A) PU75-Hep 納米纖維管狀支架的制作示意圖。(B) PU75-Hep 支架的數字圖像和掃描電子顯微照片。(C) H&E 染色的自體動脈和 PU75-Hep 支架的代表性顯微照片（植入后 1 周和 4 周）（比例尺：500 μm；縮放圖像：200 μm）。(D) 自體動脈和 PU75-Hep 支架（植入后 4 周）的代表性圖像，用 CD31（內皮細胞）和 α-SMA（平滑肌細胞）進行免疫染色（比例尺：100 μm）。
圖11 (A) 負載 TGF-β1 的 HA 和 HA-肝素水凝膠與轉谷氨酰胺酶因子 XIII 進行酶交聯的圖示。含肝素的水凝膠表現出 TGF-β1 持續釋放曲線。(B) 活/死染色后水凝膠中 hCC 的代表性圖像（比例尺：200 μm）。(C) 水凝膠中細胞增殖的定量。(D) 番紅 O 染色水凝膠的代表性圖像（比例：200 μm）。(E) 沉積的 GAG 定量，標準化為 (i) 第 0 天或 (ii) DNA 含量。(F) 兩種水凝膠中第 0 天的第 21 天聚集蛋白聚糖基因表達的定量。針對 (G) II 型膠原和 (I) I 型膠原的免疫染色水凝膠切片的代表性圖像（比例：200 μm）。兩種水凝膠中第 0 天的 (H) II 型膠原蛋白和 (J) I 型膠原蛋白在第 21 天的基因表達定量。插圖代表整個水凝膠部分的顯微照片（比例：2 毫米）。
圖12 (A) 通過原子轉移自由基聚合 (ATRP) 對肝素進行接枝修飾，以及由此產生的基于肝素的納米顆粒的基因傳遞過程。(B) 在不同重量比的 HepG2 細胞系中，PPEGMEMA-bPDMAEMA(Hep-PP-PD)、肝素-gPDMAEMA(HepPD)、聚乙烯亞胺 (PEI) 和聚(二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯) (PDMAEMA) 的 MTT 測定（平均± SD, n = 6)。(C) 與對照 PEI（最佳 N/P 比）相比，不同重量比的 Hep-PP-PD 和 Hep-PD 介導的 HepG2 細胞系的體外基因轉染效率10) 和 PDMAEMA（最佳 N/P 比為 15）。
圖13 pH 和溫度敏感肝素水凝膠的示意圖。(A) 含有 pH 和溫度敏感肝素的水凝膠的合成。(B) 在含有 VEGF 的水凝膠存在下血管形成的 H & E 染色圖像（比例尺 = 100 μm）。(C) 在存在和不存在肝素的情況下，VEGF 從水凝膠中的體外釋放模式。(D) 體外 pH 響應凝膠形成。
圖14 基于肝素的水凝膠（肝素/PEG-二丙烯酸酯），用于持續釋放結晶紫作為抗炎藥物。(A) 使用肝素甲基丙烯酰胺、線性 PEG-二丙烯酸酯和 DTT 交聯劑制造水凝膠。(B) 基于肝素的微載體用于在體外修飾巨噬細胞的表型，并在動物大腦中的巨噬細胞/小膠質細胞中創建促再生表型。
圖15 在天然葡萄柚細胞外囊泡的表面上制備基于阿霉素/肝素的納米顆粒。(A) 仿生 EV-DNPs 遞送系統的制備。(B) 施用 Cy7-EV、Cy7-DNP 和 Cy7-EV-DN2 后不同時間點的顱內 LN229-luc 神經膠質瘤小鼠的體內熒光圖像。注射 Cy7-EV、Cy7-DNP 和 Cy7-EVDN2 后 96 小時，檢查從 LN229-luc 神經膠質瘤小鼠中切除腫瘤的大腦的離體 Cy7 和 Luc 信號。(C) 無灌注和 (D) 有灌注。(E) EV-DN2 靜脈注射誘導的膠質瘤腦組織 3D 共聚焦圖像（左圖，膠質瘤邊緣；右圖，膠質瘤核心）。內皮細胞從腫瘤動脈（綠色）中滲出，細胞核用 Hoechst 33342 和 EV-DN2（紅色）染色，并在腫瘤組織內積累。（比例尺：100 m；T = 腫瘤組織；N = 正常組織。）細胞外囊泡，或EV。
圖16 用鹽水、LMWH、游離 ICG、LMWH-ICG-Lip、游離 ICG/激光和 LMWH-ICG-Lip/激光治療的小鼠的體內治療效果（808 nm，1.5 W/cm2，5 分鐘） , n=6。(A) 治療時間線示意圖；(B) 腫瘤體積；(C)第21天所有組的腫瘤；(D) 第 21 天接受各種治療的 4T1 荷瘤小鼠。(E) 腫瘤組織的蘇木精-伊紅 (HE) 組織病理學圖像（比例尺，400 μm）。(F) 腫瘤重量；(七)體重變化。(H) 肺組織上的結節總數；(I)用各種制劑處理的小鼠肺中的轉移性腫瘤位置和HE染色的肺組織切片以圓圈顯示（比例尺，400μm）。縮寫；NF=未發現腫瘤。NS = 無顯著差異。*p < 0.05，**p < 0.01。
圖17 用于電催化活性的脂肪酶-(ε-聚賴氨酸-肝素)-玻碳電極的制備。(A) 脂肪酶-(ε-聚賴氨酸肝素)-GCE 生物傳感器的制作示意圖。(B) a) (ε-PL-Hep)-GCE、b) 脂肪酶-HepGCE 和 c) 脂肪酶-(ε-PL-Hep)-GCE 在 PBS 中的循環伏安圖。(C) 校準曲線和插圖：在脂肪酶-(ε-聚賴氨酸肝素)-GCE 生物傳感器存在下，三丁酸甘油酯的微分脈沖伏安法 (DPV)。GSE：玻碳電極。
結論與展望
本文對肝素及其衍生物作為FDA批準的抗凝成分之一的優異特性和應用進行了詳細研究，由于肝素及其衍生物具有抗凝活性高、生物相容性好、可生物降解等獨特特性，衍生物，無論是合成的還是天然的，已被用于多個生物醫學領域。這些領域包括但不限于癌癥治療、組織再生、傷口愈合和生物傳感器。已經證明，肝素的某些特定特征僅在特定類型的肝素中出現，這使得它們適合特定的應用；例如，LMWH 的抗轉移、抗增殖、抗血管生成和肝臟首過逃逸能力使其在遞送應用中具有索引作用。此外，該GAG組分結構中存在不同的官能團，使其適合于具有各種特征的其他物理和化學相互作用，從而誘導肝素的新特性，從而擴展其當前的應用。
采用了基于透明質酸和明膠衍生物等不同天然材料的藥物輸送裝置，例如微針。鑒于此，基于肝素的微針貼片的制備也可能是未來的研究興趣之一。盡管對基于肝素的可注射水凝膠平臺進行了廣泛的研究，但基于肝素的平臺的實際應用可能是前瞻性的指導之一。基于肝素的平臺的工業和臨床應用研究還不夠。未來可以解決的另一個主題是合成基于肝素的共聚物或與固有導電聚合物的共混物，例如聚苯胺及其衍生物、聚吡咯和聚噻吩，用于制備導電水凝膠，用于通過光熱治療和愈合傷口及其在神經再生中的應用。另一方面，關于基于肝素的納米平臺在生物成像和抗菌活性中的應用的研究很少，因此它們是未來進一步研究有益生產和商業材料的有用領域。
原文信息
Ehsan Nazarzadeh Zare, Danial Khorsandi, Atefeh Zarepour, Hulya Yilmaz, Tarun Agarwal, Sara Hooshmand, Reza Mohammadinejad, Fatma Ozdemir, Onur Sahin, Sevin Adiguzel, Haroon Khan, Ali Zarrabi, Esmaeel Sharifi, Arun Kumar, Ebrahim Mostafavi, Negar Hosseinzadeh Kouchehbaghi, Virgilio Mattoli, Feng Zhang, Vadim Jucaud, Alireza Hassani Najafabadi, Ali Khademhosseini.
Biomedical applications of engineered heparin-based materials.
https://10.1016/j.bioactmat.2023.08.002
