注冊申報中的質量研究占有舉足輕重的地位，因為本部分內容直接關系藥品的質量可控性。質量研究的核心是藥物的質量標準，質量標準中擬定的項目以產品的關鍵質量屬性為基礎，質量標準中對應的分析方法除非通用性的如干燥失重，水分，pH值等有藥典通則的項目外，均需要進行對應分析方法學驗證，其中驗證的難度和復雜度相對較高的當屬有關物質的方法學驗證。方法學驗證無論是從眾多的文章閱讀，還是從指導原則方面都有大量的參考，可是為什么還會在驗證開始后出現接二連三的偏差，甚至嚴重時出現重新開發方法的現象呢，如何獲得一個高效能的有關物質方法學驗證，本文將從七個設計點進行詳細的闡述。
設計一：專屬性的強制降解程度宜控制在5%左右
專屬性在分析方法驗證中占首要位置，若方法的專屬性不強，存在測不準的問題，方法驗證的其他項目恐怕無法進行。于有關物質而言，驗證待測藥物中存在雜質等情況下，主峰位置是否有共出峰的情況，一般采用DAD驗證主峰純度。專屬性中需要對主成分進行強制降解考察，一方面對藥物穩定性進行考察，另一方面對方法的生命周期加以延長，在討論本設計點之前，首先需要明確的本部分驗證內容的可接受標準，即：物料平衡和降解程度，物料平衡一般規定90%-110%，關于降解程度的設置卻是眾說紛紜，一般會建議專屬性中主峰的降解程度控制在10-20%，實際上在強制降解過程中主成分會發生一些二級降解，導致無法在擬定方法的檢測波長下有效檢出，進而造成物料平衡超出90%-110%，但是如果將主成分的降解程度維持在一定的水平，如5%左右，不但可以體現分析方法對降解雜質的分析，還可以保證物料平衡。因此，專屬性中控制主成分的降解程度在5%左右，不僅能有效的驗證方法的專屬性，還能提高驗證效率。
設計二：系統適用性的分離度合理設計
有關物質的系統適用性溶液的幾種情況一般為規定濃度的特定雜質和主成分的混合溶液；供試品濃度下的主成分與限度濃度的雜質溶液或者某個降解條件下的供試品溶液。系統適用性的要求一般為主峰的保留時間，各特定雜質的相對保留時間，還有就是分離度，分離度的要求一般是規定系統適用性溶液中最難分離的兩個色譜峰之間的分離度為基線分離或者分離度不低于如1.2等這樣的固定數值。如果色譜峰形都相對對稱，那么擬定一個分離度1.1這樣的系統適用性要求也是相對可以的，但是一旦有峰形不好的雜質峰存在，就需要提高分離度的要求，避免出現線性和回收率不通過的情況發生。如下圖所示，二者的分離度需要達到2.0以上，才能保證線性和回收率的驗證符合要求：
設計三：響應較低的組分宜選用儀器精密度1%以內的儀器設備
以API為例，根據日最大劑量，按照ICH指導原則雜質的限度一般為0.1%，某個特定雜質在制定依據充分的前提下，可以設置雜質的限度大于鑒定限度，但是一般很少達到1%的水平，在0.1%附近的雜質按照指導原則要求，RSD需要不大于3%，對于響應較低的組分，限度水平的峰面積也許只有10000左右，如果選用的儀器性能相對老舊，通常在1000左右有波動，即RSD在2%左右，那么如果某一針偏離2%范圍很容易連續5針的RSD超出可接受標準。如下圖所示：
設計四：定量限濃度的選擇以本底值為參考
方法學驗證中定量限也是審評重點關注的，方法的定量限需要不小于報告限，并且需要滿足準確度和精密度的要求，定量限以信噪比不低于10為評價標準，但是實際驗證中真正的信噪比10附近很難保證定量限濃度點的回收率是符合指導原則的要求的，特別是有本底值的雜質的回收率更是需要考量定量限濃度的合理選擇，比如有關物質方法學驗證中雜質I的定量限水平S/N約10（相當于供試品的0.02%）的峰面積為1000，而供試品中雜質I的本底值為10000，如果回收率定量限濃度樣品發生正偏差，那么回收率很容易為120%，那么提高定量限濃度，使其S/N約25（相當于供試品的0.05%），峰面積約增加一倍為2500，此時如果回收率定量限濃度樣品發生正偏差，那么回收率約為108%，仍在規定的回收率限度85%-110%的范圍內。所以針對本底值比較大的特定雜質的定量限度擬定尤其需要關注，擬定的定量限濃度的峰面積僅僅為本底值的10%，定量限濃度的回收率是很難符合方法學驗證要求的。如果某個雜質的校正因子很大，與主峰的響應值相差懸殊，在提高定量限濃度水平后，定量限為報告限仍然在本底值的10%以下，可以考慮提高供試品濃度，供試品濃度也無法提高的情況下，考慮弱化本底值，即對供試品進行處理后再進行回收率試驗。
設計五：供試品溶液穩定性考察
以API的有關物質方法學驗證為例，在方法學驗證中需要應用供試品的項目包括重復性，中間精密度，回收率，耐用性等，在驗證這些項目之前，先驗證供試品的溶液穩定性很關鍵，為了提高驗證效率，一般在驗證過程中，樣品都是制備之后24小時連續進樣分析的，所以供試品如果不穩定，那么以上涉及的驗證項目均會出現偏差，一旦供試品溶液不穩定，考慮幾種解決方式更換供試品制備溶劑考察穩定性，或者制備條件加上臨用新制，或者在進樣室控溫，但是即使進樣室控溫之后，仍需要重新考察供試品的溶液穩定性。
設計六：溶劑的選擇兼顧溶解度和組分的溶劑效應
以API為例，有關物質擬定的特定雜質可能包括中間體和降解雜質，如果合成路線比較長，那么雜質之間的極性差距比較大，同時檢出這些雜質，在方法開發中，梯度洗脫是必要的，供試品的溶劑選擇一般考慮對其溶解較好的梯度系統中的兩相溶劑的適當比例混合，如果供試品的極性較小，采用有機相比例比較高的溶劑溶解，很容易發生極性較大的雜質出現色譜峰形異常的溶劑效應。雜質的色譜峰對稱性很差，線性項目容易驗證失敗，所以在溶劑的選擇中需要兼顧溶解度和組分的溶劑效應，結合設計五，還需要考慮對供試品的穩定性的影響。
設計七：供試品濃度的選擇兼顧進樣殘留和檢測靈敏度
以API為例，方法驗證中的供試品濃度并非通用的1mg/ml等，是根據各雜質的限度和儀器檢測靈敏進行設計的，但是即使在供試品的溶解性很好的前提下，也不能將供試品的濃度設置的過高，因為可能存在進樣殘留，即便洗針的溶劑對供試品的溶解度最佳，洗針的時間設置的最長，仍然存在進樣殘留，那么需要考慮供試品的濃度設計是否合理，必要時需要降低供試品濃度，避免在專屬性驗證結束后，定量限和檢測限驗證前需要大量時間去處置系統。
綜上，看似方法學的驗證是循規蹈矩的，但是里面暗藏玄機，如果沒有細心的分析和精心的設計，在驗證過程中很容易出現接連不斷的偏差，必要的預驗證和合理的設計是實現有關物質高效能驗證符合方法驗證要求的有效途徑，希望本文的討論可以給方法學驗證路上的同仁一點啟發，歡迎同仁們一起討論。
