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嘉峪檢測網 2024-07-25 09:00
摘 要： 采用高效液相色譜法測定四妙勇安湯物質基準的指紋圖譜及含量。使用ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%磷酸為流動相，梯度洗脫，流量為0.8 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為25 ℃。建立15批四妙勇安湯物質基準的高效液相色譜指紋圖譜，運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（國家藥典委員會2012 A版）進行相似度評價，對共有峰進行藥味歸屬，建立了綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷的含量測定方法。15批四妙勇安湯物質基準相似度均大于0.90，指紋圖譜中含有11個共有峰，其中歸屬于金銀花5個，玄參2個，當歸2個，甘草2個。綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷平均質量分數分別為2.24%、0.59%、0.14%。建立的15批四妙勇安湯高效液相色譜指紋圖譜精密度、穩定性良好，能夠較好的反映其化學成分組成，可用于四妙勇安湯物質基準的質量控制與評價。
關鍵詞： 四妙勇安湯基準； 高效液相色譜法； 指紋圖譜； 綠原酸； 哈巴苷； 哈巴俄苷
四妙勇安湯是國家藥品監督管理局發布的首批100首來源于古代經典名方的中藥復方制劑之一，處方經典簡潔，效用顯著。此方最早收載于漢代《華佗神醫秘傳》，后收載于清代名醫鮑相敖所著《驗方新編》中[1]，由金銀花、玄參、當歸、甘草四味中藥組成[2]，具有清熱解毒，活血止痛之功效[3]，主要用于毒熱壅盛所致的瘡疽癰瘍之證[4]，臨床上主要用于治療血栓閉塞性脈管炎、糖尿病足、動脈硬化閉塞癥[5?8]，取得了較好的療效。目前還廣泛用于痛風性關節炎、結節性紅斑等的治療[9?10]。
近年來對四妙勇安湯的提取制備工藝及質量控制研究已有報道[11?12]，但對四妙勇安湯物質基準(指按傳統工藝煎煮所得湯劑經低溫干燥而得的干浸膏)的指紋圖譜研究及指標成分含量測定涉及較少。中藥復方制劑成分復雜，指紋圖譜能夠較全面地反映其所含化學成分的種類和數量，能夠對其進行整體描述和評價，有利于控制中藥材質量，促進中藥現代化發展。
為了能夠較為全面系統地了解四妙勇安湯物質基準所含化學成分的種類和數量[13]，筆者建立了四妙勇安湯物質基準的HPLC指紋圖譜，并且研究了指紋圖譜中各色譜峰的來源，為四妙勇安湯物質基準的進一步研究和開發奠定了基礎。
1、 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：SHIMADZA LC-20AT型，配二極管陣列檢測器，日本島津儀器公司。
電子天平：NewClassic MS105DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。
超聲波清洗器：KQ500D型，昆山市超聲儀器有限公司。
煎藥壺：D5.5-L型，潮州市潮安區康雅順電器有限公司。
真空干燥箱：BZF-50型，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司。
高速多功能粉碎機：HCP-1000A型，浙江省永康市金穗機械制造廠。
超純水發生器：Milli-Q Reference型，美國密理博公司。
綠原酸對照品：質量分數為98.0%，批號110753-202018，中國食品藥品檢定研究院。
哈巴苷對照品：質量分數為96.8%，批號110729-201707，中國食品藥品檢定研究院。
哈巴俄苷對照品：質量分數為96.8%，批號110730-202110，中國食品藥品檢定研究院。
阿魏酸對照品：質量分數為99.4%，批號110773-201915，中國食品藥品檢定研究院。
3.5-O-二咖啡酰奎寧酸對照品：質量分數為99.0%，批號111894-202205，中國食品藥品檢定研究院。
4.5-O-二咖啡酰奎寧酸對照品：質量分數為99.0%，批號111782-202208，中國食品藥品檢定研究院。
甘草苷對照品：質量分數為95.0%，批號111610-202209，中國食品藥品檢定研究院。
甘草酸銨對照品：質量分數為96.2%，批號110731-202122，中國食品藥品檢定研究院。
金銀花、當歸、玄參、甘草藥材樣品：產地及批號見表1，通過隨機數表法對表1中不同品種及批次藥材進行隨機組合，見表2，北京園禾方圓植物科技股份有限公司。
表1 四妙勇安湯飲片來源信息
Tab. 1 Source information of Simiao Yong'an Decoction herbal pieces
表2 四妙勇安湯基準物隨機組合
Tab. 2 Random combination table of Simiao Yong'an Decoction
乙腈：色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。
磷酸：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。
實驗用水為純化水。
1.2 色譜條件
色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；流動相：A相為乙腈，B相為0.2%(體積分數，下同)磷酸溶液，流量為0.8 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見表3；進樣體積：10 μL，理論板數按綠原酸峰計應不低于5 000。
表3 梯度洗脫條件
Tab. 3 Conditions of mobile phase in gradient elution
1.3 溶液制備
四妙勇安湯基準樣品溶液：按照處方比例稱取金銀花90 g、玄參90 g、當歸60 g、甘草30 g，加水浸泡1 h，煎煮兩次，第一次50 min，第二次40 min，煎液濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.30～1.35 (60 ℃)，減壓干燥制成干膏粉。取干膏粉適量(含金銀花約0.5 g)，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加水適量超聲20 min，取出放冷，加水稀釋至標線，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過。
單味藥材溶液及陰性對照溶液：按處方組成分別稱取金銀花、玄參、當歸、甘草各單味藥材以及處方中缺金銀花、玄參、當歸、甘草各單味藥材的陰性對照，按樣品溶液制備方法制備各單味藥材溶液及陰性對照溶液。
綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷對照品貯備溶液：精密稱取綠原酸對照品、哈巴苷對照品、哈巴俄苷對照品適量，加入70%(體積分數，下同)乙腈溶解，制得質量濃度分別為928.00、229.20、63.20 μg/mL的對照品貯備溶液。
綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷混合對照品溶液：取綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷貯備溶液適量，加入70%乙腈，制成混合對照品溶液，綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷質量濃度分別為232.00、57.30、15.80 μg/mL。
阿魏酸、3.5-O-二咖啡酰奎寧酸、4.5-O-二咖啡酰奎寧酸、甘草苷、甘草酸銨對照品溶液：分別稱取阿魏酸對照品、3.5-O-二咖啡酰奎寧酸對照品、4.5-O-二咖啡酰奎寧酸對照品、甘草苷對照品、甘草酸銨對照品適量，加入70%乙腈，制成質量濃度均約為100 μg/mL的對照品溶液。
空白溶劑：取水作為空白溶劑。
1.4 實驗方法
取四妙勇安湯基準樣品溶液，按1.2色譜條件進樣，記錄色譜圖。將15批樣品的HPLC色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012版)，進行相似度評價。依照對照品溶液的出峰時間，對共有峰進行藥味歸屬；按照外標法計算綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷的含量。
2、 結果與討論
2.1 實驗條件的優化
2.1.1 檢測波長的選擇
采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內對綠原酸、哈巴苷及哈巴俄苷對照品溶液進行掃描，綠原酸、哈巴苷及哈巴俄苷對照品溶液紫外吸收光圖譜見圖1。由圖1可見，綠原酸對照品溶液在218、326 nm處有較強吸收；哈巴苷對照品溶液在195 nm處有較強吸收，哈巴俄苷對照品溶液在280 nm處有較強吸收，但這幾個吸收峰并不重疊。3種對照品溶液在紫外末端均有吸收，因此綜合考慮下，確定檢測波長為210 nm。
圖1 綠原酸、哈巴苷及哈巴俄苷對照品的紫外吸收光譜
Fig. 1 UV spectrograms of chlorogenic acid，harpagide，harpagoside reference substances
2.1.2 流動相的選擇
分別考察甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸三種流動相體系，以不同梯度進行分析，以色譜峰峰形、分離度等為考察指標。以甲醇-0.1%磷酸為流動相時，綠原酸色譜峰形較差，色譜保留時間較長，與前后雜質峰的分離度均小于1.5；以乙腈-0.1%磷酸為流動相時，綠原酸峰形較好，但是與前后雜質峰的分離度均小于1.5；以乙腈-0.2%磷酸為流動相時，綠原酸峰形較好，與前后雜質峰的分離度均大于1.5，哈巴苷、哈巴俄苷與前后雜質峰的分離度均符合要求，所有色譜峰能達到基本分離，因此最終選擇乙腈-0.2%磷酸流動相體系，梯度洗脫。
2.1.3 含量測定中指標成分的選擇
四妙勇安湯君藥為金銀花[14]，用藥量占總藥量的三分之一；臣藥為玄參，用藥量亦為同樣占總藥量的三分之一。金銀花的主要成分為綠原酸，玄參的主要成分為哈巴苷與哈巴俄苷[15]，所以選擇測定這3種指標成分的含量，以保證四妙勇安湯物質基準的有效性和穩定性。
2.1.4 樣品溶液制備方法
在指紋圖譜方法建立時，對S1樣品制備方法進行了考察。提取溶劑為水，考察不同提取方式(超聲法、回流法)及提取時間(分別為10、20、30、60 min)下目標成分測定結果，結果見表4。綜合分析后選擇提取率最高的組合即超聲20 min的提取方法。
表4 不同提取方式及不同提取時間下綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷質量分數測定結果
Tab. 4 different extraction methods and different extraction times of chlorogenic acid，harpagide，harpagoside
2.2 四妙勇安湯基準樣品指紋圖譜
2.2.1 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價
取15批基準樣品粉末適量(相當于金銀花0.5 g)，按1.3方法制備樣品溶液，再按1.2色譜條件進樣，記錄其HPLC指紋圖譜，然后將15批基準樣品的HPLC色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012版)，進行指紋圖譜分析，以S1為參照圖譜，時間窗寬度0.1 s，設置中位數法，全譜峰匹配，生成對照指紋圖譜。空白溶劑圖譜、基準樣品對照圖譜及15批疊加圖譜，見圖2～圖4。
圖2 空白溶劑色譜圖
Fig. 2 chromatogram of blank solvent
圖3 四妙勇安湯基準對照圖譜
Fig. 3 reference fingerprint chromatogram of Simiao Yong'an decoction substance benchmarks
圖4 15批四妙勇安湯基準樣品指紋圖譜疊加
Fig. 4 15 batches fingerprint chromatogram of Si miao Yong'an decoction substance benchmarks
2.2.2 共有峰的指認及歸屬
經過對15批基準樣品的HPLC指紋色譜圖的比較，認定其中11個峰作為共有峰。通過對基準樣品、單味飲片、對照品、陰性樣品及空白溶劑的圖譜比對，指認1#峰為哈巴苷；3#峰為綠原酸；5#峰為阿魏酸；6#峰為甘草苷；7#峰為3.5-O-二咖啡酰奎寧酸；8#峰為4.5-O-二咖啡酰奎寧酸；9#峰為哈巴俄苷；10#峰為甘草酸銨。確定了11個共有峰的歸屬，其中2#、3#、4#、7#、8#峰來自于金銀花；峰5#、11#來自于當歸；1#、9#峰來自于玄參；6 #、10 #峰來自于甘草。
2.2.3 指紋圖譜精密度試驗
精密稱取S1樣品，平行稱取6份，按1.3方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件進樣，記錄色譜圖。以共有峰3號(綠原酸)為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算相對標準偏差，結果見表5。各共有峰相對保留時間的相對標準偏差小于2%，相對峰面積的相對標準偏差小于3%，表明該方法精密度良好。
表5 15批基準樣品指紋圖譜方法學驗證結果（n=6）
Tab. 5 validation method used for15 batches fingerprint chromatogram of Simiao Yong'an decoction substance benchmarks
2.2.4 指紋圖譜穩定性試驗
精密稱取S1樣品，按1.3方法制備樣品溶液。按1.2色譜條件，分別于0、2、4、6、8、24 h進樣，記錄色譜圖。以共有峰3號(綠原酸)為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算相對標準偏差(見表5)。測得各共有峰相對保留時間的相對標準偏差小于2%，相對峰面積的相對標準偏差小于3%，表明樣品溶液在24 h內穩定。
2.2.5 指紋圖譜相似度計算結果
采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012版)，以15批基準樣品的HPLC指紋圖譜生成的對照指紋圖譜為參照，進行整體相似度評價，見表6。15批基準樣品相似度均大于0.90，表明其差異較小，制備工藝穩定、重現性良好。
表6 15批基準樣品相似度測定結果
Tab. 6 the similarity of the 15 batches substance benchmarks
2.3 四妙勇安湯基準樣品中3種指標成分含量測定
2.3.1 線性方程和檢出限
分別精密吸取對照品貯備溶液適量，置于同一容量瓶中，加入70%乙腈稀釋至標線，得不同質量濃度的系列對照品線性混合溶液。取上述溶液按1.2色譜條件進樣測定，以各成分對照品質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，繪制標準工作曲線，計算線性方程，見表7。取混合對照品溶液逐級稀釋，當信噪比為3時，測得綠原酸、哈巴苷及哈巴俄苷的檢出限分別為為0.01、0.05、0.02 μg/mL。
表7 三種指標成分的線性方程與線性范圍
Tab. 7 Regression equation and linear range of three components
2.3.2 精密度試驗
精密稱取S1樣品，按1.3方法平行制備6份樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，結果見表8。由表8可見，綠原酸、哈巴苷及哈巴俄苷含量測定結果的相對標準偏差分別為0.88%、1.80%、1.90%，表明該方法的精密度良好。
表8 精密度試驗結果
Tab. 8 Test results of precision
2.3.3 穩定性試驗
精密稱取S1樣品，按1.3方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件，分別在第0、2、4、6、8、24 h進樣，記錄色譜圖，數據見表9。由表9可見，綠原酸、哈巴苷及哈巴俄苷峰面積測定結果的相對標準偏差分別為0.46%、0.58%、0.62%，表明樣品溶液在24 h內穩定。
表9 穩定性試驗結果
Tab. 9 Results of stability test
2.3.4 樣品加標回收試驗
精密稱取S1樣品，按照對照品量與樣品中待測成分量0.8∶1、1∶1、1.2∶1的比例加入綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷對照品各3份(n=9)，按1.3方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件進樣，測定樣品中3種指標成分的含量，計算加樣回收率，見表10。由表10可見綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷平均回收率分別為99.91%、99.84%、100.34%；測定結果的相對標準偏差分別為0.72%、0.93%、1.85%，表明該方法樣品加標回收率良好。
表10 樣品加標回收試驗結果
Tab. 10 Results of test for sample spike recovery
3、 結語
按照中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，計算15批四妙勇安湯基準樣品指紋圖譜相似度均大于0.90，同時對11個共有峰進行了來源歸屬，其中歸屬于金銀花、玄參、當歸、甘草的色譜峰分別為5個、2個、2個、2個。通過對照品保留時間及紫外光譜吸收曲線對比，對其中8個色譜峰進行了定性鑒別。15批四妙勇安湯基準樣品中綠原酸、哈巴苷、哈巴俄苷平均含量分別為2.24%、0.59%、0.14%。所建立的四妙勇安湯基準HPLC指紋圖譜能夠反映其所含化學成分的種類和數量，實現了關鍵質量屬性成分的表征。該指紋圖譜具有科學性、合理性及可行性，能為其質量控制和評價提供依據。
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來源：化學分析計量
