您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發
嘉峪檢測網 2024-08-02 08:18
摘 要： 建立高效液相色譜波長切換法同時測定復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液中苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯6種防腐劑含量。采用Waters XSelect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，甲醇作為流動相A，0.1%乙酸銨溶液（用乙酸調節pH值至4.5）作為流動相B，梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長分別為226、256 nm，進樣體積為10 μL。6種防腐劑在質量濃度0.2～28.6 μg/mL內與色譜峰面積呈良好線性關系，相關系數均為0.999 9，精密度試驗測試結果的相對標準偏差為0.1%～0.6%，樣品加標平均回收率為98.8%～102.2%。該方法操作簡單，專屬性強，準確度高，重復性好，可用于復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液的防腐劑檢測，為生產企業的處方、生產工藝和質量標準的把控提供參考作用。
關鍵詞： 復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液； 防腐劑； 波長切換； 高效液相色譜
復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液是以鹽酸異丙嗪、愈創木酚磺酸鉀、氯化銨等多種組分作為原料配制而成的復方感冒藥，臨床上用于感冒及過敏性支氣管炎引起的咳嗽、多痰。鹽酸異丙嗪為抗組胺藥，能對抗過敏反應所致的毛細血管擴張，降低毛細血管通透性，有輕度的支氣管平滑肌解痙作用，亦有明顯的中樞安定作用及一定的鎮咳作用；愈創木酚磺酸鉀是強力祛痰劑，使呼吸道腺體分泌增加，痰液被稀釋，易于咳出。氯化銨為鹽類祛痰藥，能反射性地增加呼吸道黏膜腺體的分泌，從而使痰易于咳出，有利于粘痰的清除。
多劑量口服液體制劑由于多次開啟使用，容易被微生物污染，易引起質量的變化，往往需要加入適量的防腐劑來抑制微生物滋生[1]。苯甲酸、山梨酸及羥苯酯類均具有抑制微生物的繁殖作用，是口服溶液中常用的防腐劑[2?3]。但是防腐劑如果攝入過量會對人體產生一定的毒副作用，對人體的健康產生危害[4?5]。目前很多藥品標準中均未設置防腐劑含量測定的方法，導致藥物的監管存在一定的難度。
目前防腐劑的測定方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[6?9]、氣相色譜-質譜(GC-MS)法[10?11]、毛細管電泳(CE)法[12?13]和液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法[14?15]。GC-MS、LC-MS/MS使用成本高，且樣品處理相對復雜，對于企業來說普及性不高；CE方法樣品進樣量有限，且分離重現性易受電滲的影響。筆者采用HPLC波長切換法，對于測定不同種類的防腐劑來說靈敏度高，響應好，采用梯度洗脫能更好的分離6種防腐劑。在廠家提供的處方中發現，不少廠家都添加了苯甲酸或苯甲酸鈉、羥苯乙酯作為防腐劑，為了考察其添加的量是否在規定的范圍之內，筆者根據6種防腐劑的特征，建立了HPLC波長切換法測定復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液中6種防腐劑的含量，為該口服溶液防腐劑的控制、篩查提供參考依據。
1、 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
電子分析天平：XD205DU型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
高效液相色譜儀：Agilent 1260型，配DAD檢測器、ChemStation工作站，美國安捷倫科技有限公司。
超純水儀：Milli-Q3800型，美國密里博公司。
苯甲酸對照品、山梨酸對照品、羥苯甲酯對照品、羥苯乙酯對照品、羥苯丙酯對照品、羥苯丁酯對照品：質量分數分別為99.9%、99.6%、99.9%、99.9%、99.6%、99.8%，中國食品藥品檢定研究院。
復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液樣品：共99個批次，來自全國14個生產企業。
甲醇、乙腈：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司。
乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
1.2 色譜條件
色譜柱：Waters XSelect HSS T3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世科技有限公司)；柱溫：26 ℃，進樣量：10 μL；檢測波長：226 nm (苯甲酸)和256 nm (山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和羥苯丁酯)；流動相：以甲醇作為流動相A，以0.1%乙酸銨溶液(用乙酸調節pH值至4.5)作為流動相B，流量為1.0 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序詳見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution procedure
1.3 溶液配制
混合對照品儲備液：分別精密稱取苯甲酸11.44 mg、山梨酸10.84 mg、羥苯甲酯10.77 mg、羥苯乙酯10.72 mg、羥苯丙酯10.73 mg、羥苯丁酯10.81 mg，置于同一20 mL容量瓶中，加入20%（體積分數，下同）乙腈水溶液使溶解并稀釋至標線，每種防腐劑的質量濃度約為500 μg/mL。
混合對照品溶液：精密量取混合對照品儲備液1 mL，置于20 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液稀釋至標線。
系列混合標準工作溶液：精密吸取混合對照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液稀釋至標線，搖勻，然后精密量取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別置于不同10 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容置標線，配制成系列混合標準工作溶液。
樣品溶液：取復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液樣品0.2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液定容至標線。
陰性空白溶液：按處方比例制備不含苯甲酸、山梨酸及羥苯酯類的空白輔料，按處方配比精密取樣，置于100 mL容量瓶中，加水使溶解并定容至標線，作為陰性空白儲備溶液；精密量取1 mL，置于100 mL容量瓶中，加水定容至標線。
1.4 實驗方法
取混合對照品溶液、系列混合標準工作溶液、樣品溶液、陰性空白溶液及20%乙腈水溶液，按照1.2色譜條件進行試驗分析，記錄色譜圖及色譜峰面積，按外標法計算6種防腐劑的含量。
2、 結果與討論
2.1 流動相組成的考察
考察流動相為甲醇-水和乙腈-水組成時測定結果的差異發現，用甲醇作為有機相時各色譜峰的峰型比較好。再考察流動相為甲醇-水和甲醇-0.1%乙酸銨溶液組成時測定結果的差異發現，在水中加入0.1%乙酸銨有助于分離度的提高，同時拖尾因子減小，更有利于測定。羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯在流動相為甲醇-0.1%乙酸銨溶液(體積比為55∶45)時出峰時間很慢，需要增加甲醇的比例才能洗脫出來，因此選擇了梯度洗脫的模式。考察0.1%乙酸銨溶液不同pH值(3.0、3.5、4.0、5.0)對測定的影響，結果顯示甲醇-0.1%乙酸銨溶液(乙酸調pH值為4.5)為流動相時，峰型好且出峰時間適宜，分離度較好，理論塔板數高。
2.2 檢測波長的選擇
分別提取苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的DAD掃描圖，結果發現苯甲酸最大吸收為226 nm，羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯最大吸收為256 nm。安捷倫1260液相色譜儀可以選擇多個通道同時測定，也可選擇在某個時間段進行波長切換測定，因此苯甲酸出峰后直接切換成256 nm，從而能夠滿足6個防腐劑都在最大吸收波長處測定，以便結果的分析。
2.3 專屬性考察
取1.3項下的混合對照品溶液、加標樣品溶液、陰性空白溶液，在1.2色譜條件下分別進樣測定，記錄色譜圖見圖1。混合對照品溶液中6種防腐劑的分離度均大于5.0，樣品溶液中各色譜峰的分離度均大于2.0，陰性空白溶液不干擾測定。
圖1 HPLC典型色譜圖
Fig. 1 Typical chromatogram of HPLC
1—苯甲酸； ；2—山梨酸； 3—羥苯甲酯；4—羥苯乙酯； 5—羥苯丙酯； 6—羥苯丁酯
2.4 線性關系
取系列混合標準工作溶液，按1.2色譜條件進樣，測定各色譜峰面積。分別以防腐劑峰面積y為縱坐標，對照品質量濃度x (μg/mL)為橫坐標，繪制標準工作曲線，計算線性回歸方程。將進樣得到的信噪比，折算當信噪比S/N=3時的質量濃度確定為檢出限，結果見表2。
表2 六種防腐劑的線性關系
Tab. 2 Linear relationship of six preservatives
2.5 穩定性試驗
取混合對照品溶液，于室溫放置，分別于第0、1、2、4、8、16、24 h時進樣測定，測定各防腐劑的色譜峰面積，按外標法計算所測得的苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的含量及相對標準偏差(RSD)，見表3。表3結果表明，樣品溶液在24 h內穩定。
表3 穩定性試驗結果
Tab. 3 Result of stability test
2.6 精密度試驗
精密量取陰性空白溶液0.2 mL，加入混合對照品儲備液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容至標線，平行配制6份，按1.2色譜條件進樣，記錄峰面積，結果見表4。由表4可見，苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯，羥苯丙酯，羥苯丁酯的RSD為0.1%～0.6%，表明該方法精密度良好。
表4 方法精密度試驗結果
Tab. 4 Method precision test results
2.7 樣品加標回收試驗
用混合對照品儲備液作為加標回收標液，精密量取加標回收標液0.8、1.0、1.2 mL，每個濃度水平取3份，共9份，分別加入陰性空白溶液0.2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液，定容至標線。按1.2色譜條件測定各防腐劑的色譜峰面積，并計算回收率，結果見表5。各防腐劑的平均回收率為98.8%～102.2%，表明樣品加標回收率良好。
表5 樣品加標回收試驗結果
Tab. 5 Sample recovery test results
3、 結論
用Waters XSelect HSS T3柱，以甲醇作為流動相A，0.1%乙酸銨溶液(用乙酸調節pH值至4.5)作為流動相B，流量為1.0 mL/min；進行梯度洗脫，檢測波長為226 nm (苯甲酸)和256 nm (山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和羥苯丁酯)，經方法學驗證，用該方法同時測定6種防腐劑，操作簡單，分離度好，靈敏度高，為復方愈創木酚磺酸鉀口服溶液防腐劑的控制、篩查提供參考依據，進一步加強藥品監管，提高藥品質量，從而保證藥品的抑菌效力。
參考文獻：
1 王宏亮，陳盼盼，何計龍，等. HPLC測定口服液體制劑中防腐劑和甜味劑的含量［J］.中國現代應用藥學，2015，32（7）：844.
WANG Hongliang，CHEN Panpan，HE Jilong，et al. Content determination of preservatives and sweeteners in oral liquid preparations by HPLC［J］. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2015，32（7）：844.
2 張府君，馮貞，王海花，等. HPLC法同時測定31批次消栓口服液中6種防腐劑的含量［J］.中國現代中藥，2019，21（4）：528.
ZHANG Fujun，FENG Zhen，WANG Haihua，et al. Content determination of six preservatives in 31 batches xiao shuan oral liquid by HPLC［J］. Modern Chinese Medicine，2019，21（4）：528.
3 袁媛，鐘水生，張華鋒，等. HPLC法同時測定小兒咳喘靈口服液中7種防腐劑的含量［J］.中國藥師，2020，23（12）：2 473.
YUAN Yuan，ZHONG Shuisheng，ZHANG Huafeng，et al. Simultaneous determination of seven preservatives in Xiaoer Kechuanling Oral Liquid by HPLC［J］. Chinese Pharmacist，2020，23（12）：2 473.
4 陳曦，劉美欣.眼用制劑中防腐劑的研究應用進展［J］.天津藥學，2013，25（ 5）：54.
CHEN Xi，LIU Meixin. Advances in research and application of preservatives in ophthalmic preparations［J］. Tianjin Pharmacy，2013，25（5）：54.
5 李中東，張云軒，郭燕萍，等.羥苯酯類防腐劑的不良反應［J］.中國藥物警戒，2012，9（5）：303.
LI Zhongdong，ZHANG Yunxuan，GUO Yanping，et al. Adverse drug reactions induced by parabens used as preservatives［J］. Chinese Journal of Pharmacovigilance，2012，9（5）：303.
6 李岳，張憲.超高效液相色譜法測定桔貝合劑中6種防腐劑［J］.化學分析計量，2021，30（4）：33.
LI Yue，ZHANG Xian. Determination of six preservatives in Jubei mixture by ultra performance liquid chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage，2021，30（4）：33.
7 曾慶花，黃慧，楊娜，等.高效液相色譜法測定復方甘草口服溶液中8 種防腐劑［J］.化學分析計量，2022，31（7）：18.
ZENG Qinghua，HUANG Hui，YANG Na，et al. Determination of 8 preservatives in Compound Glycyrrhiza Oral Solution by high performance liquid chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage，2022，31（7）：18.
8 張筱，隋海山，李現菊，等. HPLC-DAD法同時測定復方甘草片中3種有效成分和5種防腐劑［J］.中成藥，2022，44（2）：376.
ZHANG Xiao，SUI Haishan，LI Xianju，et al. Simultaneous determination of three effective constituents and five preservatives in Compound Gancao Tablets by HPLC-DAD［J］. Chinese Traditional Patent Medicine，2022，44（2）：376.
9 蘇靜華，顧炳仁，邢以文，等. HPLC測定三種兒童用醫院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量［J］.中國執業藥師，2016，13（10）：13.
SU Jinghua，GU Bingren，XING Yiwen，et al. Content determination of ethylparaben as a preservative in three hospital preparations for children by HPLC［J］. China Licensed Pharmacist，2016，13（10）：13.
10 陳安東，吳兆偉，余倩，等. GC/MS法同時分析液體制劑及口服液型保健品中31種防腐劑和抗氧化劑［J］.質譜學報，2014，35（5）：438.
CHEN Andong，WU Zhaowei，YU Qian，et al. Simultaneous determination of 31 preservatives and antioxidants in liquid preparation and healthcare dietetic liquid by GC/MS［J］. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2014，35（5）：438.
11 許勇，鐘吉強，鄭榮.氣相色譜-質譜法測定化妝品中17種防腐劑的含量［J］.香料香精化妝品，2020（6）：72.
XU Yong，ZHONG Jiqiang，ZHENG Rong. Determination of the contents of seventeen kinds of preservative in cosmetic by GC-MS［J］. Flavour Fragrance Cosmetics，2020（6）：72.
12 廖乃英，袁孝曄.膠束電動毛細管電泳法同時測定麻杏止咳糖漿中的6種防腐劑［J］.中國現代應用藥學，2020，37（3）：321.
LIAO Naiying，YUAN Xiaoye. Simultaneous determination of six preservatives in Maxing Zhike Syrup by MEKC-DAD［J］. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2020，37（3）：321.
13 廖乃英，袁孝曄. MEKC法同時測定小兒止咳糖漿中6種防腐劑的含量［J］.中國藥師，2020，23（2）：381.
LIAO Naiying，YUAN Xiaoye. Simultaneous determination of six preservatives in Pediatric Cough Syrup by MEKC［J］. China Pharmacist，2020，23（2）：381.
14 朱虹，鄭增堯，徐寧，等.液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒濕巾中的15種防腐劑［J］.化學分析計量，2022，31（1）：18.
ZHU Hong，ZHENG Zengyao，XU Ning，et al. Determination of 15 preservatives in baby wipes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2022，31（1）：18.
15 姚幫本，包磊，韓楓，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定濕巾中5種異噻唑啉酮類防腐劑［J］.化學分析計量，2018，27（2）：9.
YAO Bangben，BAO Lei，HAN Feng，et al. Determination of 5 isothiazolinone preservatives in wet wipes by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2018，27（2）：9.
來源：Internet
