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介紹：

聚山梨酯（吐溫，PS）是一類兩親性非離子表面活性劑家族，其中，聚山梨酸酯80（吐溫80）是生物藥物制劑中使用最廣泛的“明星”表面活性劑，可防止蛋白質(zhì)在儲存、運(yùn)輸條件變性、聚集、表面吸附以及絮凝作用。吐溫80是一種混合物，主要成分是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。

作為常用的藥物輔料，市售注射用吐溫80主要有MC（多藥典級）和CP（中國藥典級）兩種級別，其主要差異在油酸含量上，見表1。其中，CP級別常用供應(yīng)商日油和南京威爾，MC級別有JT、Sigma和禾大等。

吐溫80可以通過氧化和水解途徑降解，見圖1，其中水解反應(yīng)是化學(xué)誘導(dǎo)的或酶催化的，氧化反應(yīng)一般由化學(xué)誘導(dǎo)。吐溫80作為生物制劑的一種保護(hù)劑輔料使用，但也可能影響蛋白質(zhì)制劑的質(zhì)量，從而對功效、安全性和穩(wěn)定性起到不利作用。目前，藥品監(jiān)管部門對吐溫80的控制要求越來越嚴(yán)格。

圖1 吐溫80的主要降解途徑

有很多學(xué)者對吐溫80進(jìn)行了大量研究，下面從吐溫80的優(yōu)缺點(diǎn)、含量測定方法、以及面臨挑戰(zhàn)幾個方面進(jìn)行介紹。

吐溫80的優(yōu)點(diǎn)：

PS80是生物制劑中最常用的表面活性劑，在大多數(shù)商業(yè)治療性蛋白質(zhì)制劑中用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。這是由于以下因素：

1）生物相容性高；

2）低毒性；

3）有效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用。即使在低濃度下（生物制劑中常用濃度為0.1-1.0mg/ml），它們也提供了足夠的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。這是由于PS80的親水親脂平衡（HLB）值高和臨界膠束濃度（CMC）低，PS80的CMC僅為1.4*10-2g/L。

蛋白質(zhì)具有天然的不穩(wěn)定性，易受到外部條件的影響，如溫度、震蕩、剪切力、緩沖體系及離子強(qiáng)度等，甚至自身的蛋白濃度或純度的改變。其中，所有蛋白質(zhì)變性降解的問題中，聚集的問題尤為嚴(yán)重。下游的制劑開發(fā)中常常使用吐溫80作為蛋白的保護(hù)劑。聚山梨酯穩(wěn)定蛋白質(zhì)的機(jī)理，通常認(rèn)為界面競爭和表面活性劑-蛋白質(zhì)復(fù)合這兩種主要機(jī)理。

吐溫80主要通過界面競爭作用來穩(wěn)定蛋白質(zhì)，吐溫80的表面活性比蛋白質(zhì)（即單克隆抗體（mAbs））高很多，因此，吐溫80可以競爭性地占據(jù)界面位置，抑制蛋白質(zhì)吸附到氣液交界面，進(jìn)而減少與空氣接觸造成的氧化或聚集，也有效防止蛋白質(zhì)在制造過程、樣品處理和存儲中在界面處展開。

吐溫80還可以通過與蛋白質(zhì)直接相互作用，增加蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性。抗體可能會通過其分子間輸水作用形成聚集體。吐溫80可通過與蛋白質(zhì)表面上的疏水相互作用，從而防止蛋白質(zhì)聚集甚至顆粒的產(chǎn)生。

吐溫80的缺點(diǎn)：

前面提到吐溫80其實是一種混合物，市售的預(yù)期結(jié)構(gòu)聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯）僅占吐溫80總量的20％。如圖2所示，異質(zhì)性主要來來源與工藝相關(guān)的副產(chǎn)物雜質(zhì)，其中不僅含有單酯（預(yù)期結(jié)構(gòu)），還含有二酯、多酯，甚至未成酯的脂肪酸鏈。此外，前面還提到（見圖1），吐溫80可以發(fā)生水解反應(yīng)及氧化反應(yīng)導(dǎo)致降解，產(chǎn)生脂肪酸鏈及氧化物，以上導(dǎo)致對吐溫80的表征成為了難點(diǎn)。

圖2 吐溫80主要的化學(xué)結(jié)構(gòu)

吐溫80的表征：

吐溫80的結(jié)構(gòu)缺乏強(qiáng)發(fā)色團(tuán)，無法直接檢測到容易獲得的紫外可見光及熒光。目前，很多研究學(xué)者已經(jīng)開發(fā)了多種表征方法來控制吐溫80的不同性質(zhì)，表2總結(jié)了幾種常見含量檢測方法的原理及優(yōu)缺點(diǎn)。然而，由于不同亞種（如未酯化、單酯、多酯）及降解產(chǎn)物（如水解、氧化）對總吐溫80含量結(jié)果的貢獻(xiàn)值存在顯著差異，因此用不同原理方法測定的吐溫80含量顯示出明顯的差異。

此外，還采用MS或CAD（其中主要應(yīng)用色譜與MS聯(lián)合應(yīng)用）來分析主要吐溫80亞種的組成及降解物，例如小的有機(jī)分子，游離脂肪酸等，研究解聚山梨酯降解途徑。藥典方法、HPLC-ELSD/CAD方法對水解產(chǎn)物較為敏感，HPLC-FMA也可測出樣品水解，然而測定吐溫80氧化方面上，F(xiàn)MA方法更勝一籌，綜合來看，HPLC-FMA方法更適用于PS80含量的檢測。截止目前為止，吐溫80的表征方法層出不窮，但具有各自方法的優(yōu)點(diǎn)及弊端，其仍然是一項分析挑戰(zhàn)，必要時可采取多種檢測方式共同評價。

面臨的挑戰(zhàn)：

吐溫80的水解也就是酯的水解，反應(yīng)生成的游離脂肪酸鏈可形成聚集甚至可見顆粒，并且可能與蛋白結(jié)合形成脂肪酸-蛋白復(fù)合物。在典型的蛋白質(zhì)制劑pH（4-7）下，吐溫80的水解受到限制。有文獻(xiàn)表明，酶誘導(dǎo)的吐溫80水解是影響產(chǎn)品質(zhì)量的可見和亞可見顆粒形成的主要原因，實際生產(chǎn)中上游工藝帶來的Hcp脂肪酶是催化PS80水解的一個重要因素，其具有與目標(biāo)蛋白相似的理化性質(zhì)，因此很難完全去除。即使優(yōu)化純化工藝去除Hcp，但遠(yuǎn)低于檢測限的極少量Hcp（ppm級別）也可催化PS80的水解。

吐溫80可能被光照、溫度，過氧化物、氧氣或痕量金屬離子等影響因素氧化，氧化位置常見脂肪酸鏈雙鍵、母核的醚鍵和部分酯鍵，降解產(chǎn)物有自由基、過氧化物、游離脂肪酸、短鏈烷烴、醛、酮、酸等。而生成的過氧化物可能繼而引起蛋白質(zhì)氧化。

泊洛沙姆188（P188）是另一種在蛋白質(zhì)制劑中用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的賦形劑，盡管不如吐溫80使用廣泛。P188因不具備酯鍵，不會有發(fā)生水解的風(fēng)險，主要通過氧化形式在溶液中降解，形成氧化的聚氧乙烯（POE）和聚環(huán)氧丙烷（PPO）。但P188在上市品種中應(yīng)用局限，可能存在長期放置過程中潛在風(fēng)險。

因此，推薦使用一些手段減少吐溫對蛋白質(zhì)的負(fù)面影響，如2-8℃低溫儲存、充氮、避光保護(hù)；通過上游工藝優(yōu)化降低Hcp；加入抗氧化劑、金屬絡(luò)合劑等。其中抗氧化劑如甲硫氨酸、賴氨酸、色氨酸等，金屬絡(luò)合劑如EDTA、DTPA等。

參考文獻(xiàn)：

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