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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-10-08 21:03
摘 要： 建立柱前衍生-高效液相色譜（HPLC）聯(lián)合紫外檢測分析方法測定冰乙酸中微量乙酸酐的含量。樣品采用嗎啡啉為柱前衍生劑，色譜柱為Atlantis T3（250 mm×4.6 mm， 5 μm），以磷酸水溶液（pH 3.0）-甲醇（體積比為95∶5） 為流動相，流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm。乙酸酐的質(zhì)量濃度在2.60~25.97 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.8 μg/mL，定量限為3 μg/mL。平均樣品加標(biāo)回收率為92.8%~99.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%~2.3%（n=6）。該方法可用于冰乙酸中微量乙酸酐的含量測定。
關(guān)鍵詞： 嗎啡啉； 乙酸酐； 冰乙酸； 柱前衍生； 高效液相色譜法
冰乙酸是一種有機(jī)一元酸，具有強(qiáng)烈刺激性氣味，在試劑分析、非水滴定等方面運(yùn)用廣泛，同時冰乙酸是一種重要的有機(jī)合成原料，多應(yīng)用于醋酸纖維、農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料等生產(chǎn)行業(yè)[1?3]。目前，乙酸的工業(yè)制備方法主要為甲醇低壓羰基合成法、丁烷氧化法和乙醛氧化法[4]。由于生產(chǎn)工藝的差異，乙酸中的雜質(zhì)也多種多樣，GB/T 676—2007 《化學(xué)試劑 乙酸(冰醋酸)》顯示冰乙酸中常含有乙酸酐、重金屬、硫酸鹽等雜質(zhì)。
乙酸酐，又名乙酐或醋酐，其分子結(jié)構(gòu)是由兩分子乙酸失去一分子水而形成的酸酐，可用作溶劑、脫水劑和聚合物引發(fā)劑。此外，乙酸酐還是一種比較活潑的乙酰化試劑，能與醇、酚和胺等形成乙酸酯和乙酰胺類化合物[5?7]，常用于生產(chǎn)纖維素乙酸酯、醫(yī)藥、農(nóng)藥和香料等。由于冰乙酸中乙酸酐含量過多，可能導(dǎo)致后續(xù)合成產(chǎn)品中存在較多小分子副產(chǎn)物，在醫(yī)藥領(lǐng)域中，會增大未知雜質(zhì)的產(chǎn)生風(fēng)險，降低原料藥或制劑的質(zhì)量，因此對冰乙酸中乙酸酐含量的測定在藥品研發(fā)中具有重要的研究意義。
國內(nèi)外檢測乙酸及其衍生物的研究文獻(xiàn)較多[8?12]，但大多不適用于檢測乙酸酐，目前檢測酸酐類化合物的方法主要有比色法[13]、化學(xué)滴定法[14]和氣相色譜法[15?18]。其中，比色法是通過在酸性條件下反應(yīng)生成紅色的異羥肟酸鐵的方法來測定酸酐含量，操作步驟繁瑣，高氯酸具有刺激性、強(qiáng)腐蝕性等特點(diǎn)，且人工目視比色的準(zhǔn)確度相對于儀器分析的誤差比較大；化學(xué)滴定法的原理是利用酸酐水解生成酸，與堿性標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)來測定其含量，該方法檢出限較高，指示劑變色的敏銳程度和用量直接影響定量結(jié)果，重現(xiàn)性較差，而且樣品中若含有其他酸性化合物，易對測定結(jié)果造成干擾；在使用氣相色譜法時，如果樣品自身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，需要開發(fā)特殊的前處理方式，耗時且費(fèi)用成本較高。此外，高溫易導(dǎo)致有機(jī)酸脫水生成酸酐，造成酸酐測試誤差[19]。近年來，報道用液相色譜方法檢測乙酸酐的文章極少，楊成鈺等[20]利用二甲胺衍生高效液相色譜（HPLC）法測定嗎啉噁酮中殘留的少量乙酸酐，但是該方法的衍生條件操作復(fù)雜，試劑種類較多，二氯甲烷毒害性強(qiáng)且易揮發(fā)。建立一種用于檢測冰乙酸中乙酸酐的既簡單易操作又可靠環(huán)保的樣品前處理方法是十分必要的。
筆者根據(jù)嗎啡啉與乙酸酐易反應(yīng)生成乙酰嗎啉[19]的原理，首次提出了以嗎啡啉作為衍生化試劑的柱前衍生化HPLC法，該方法衍生效率高、重復(fù)性好、快速且定量準(zhǔn)確，適用于測定冰乙酸中微量乙酸酐的含量，從而達(dá)到控制冰乙酸的產(chǎn)品質(zhì)量，為藥品研發(fā)工作提供指導(dǎo)性建議。
1、 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：1260型，帶有紫外-可見檢測器，美國安捷倫科技有限公司。
多參數(shù)測試儀：S975型，測量精度為0.01，瑞士梅特勒-托利多有限公司。
分析天平：MSA225S-1CE-DA型，感應(yīng)量為0.01 mg，德國賽多利斯集團(tuán)。
乙酸酐：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98.5%，批號為20210820，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。
嗎啡啉：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.0%，批號為F181208，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
乙腈、甲醇：均為色譜純，天津市康科德科技有限公司。
磷酸、氫氧化鈉：均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
冰乙酸：色譜純，批號為K54173956210，德國默克公司。
實(shí)驗(yàn)用水：超純水，由密理博純水儀制得。
1.2 色譜條件
色譜柱：Waters Atlantis T3柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm，美國沃特世公司）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣體積：40 μL；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇-pH為3.0磷酸水溶液（體積比為5∶95）；流量：1.0 mL/min；洗脫方式：等度洗脫。
1.3 實(shí)驗(yàn)步驟
1.3.1 溶液配制
磷酸水溶液：于1 000 mL水中加入磷酸0.7 mL，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0。
嗎啡啉衍生劑：取嗎啡啉適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液。
空白溶液：精密量取1.0 mL乙腈，置于20 mL量瓶中，加嗎啡啉衍生劑0.5 mL，室溫下衍生1 min，加磷酸水溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。
對照品儲備液：取乙酸酐適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋成質(zhì)量濃度為625 μg/mL的溶液，作為對照品儲備液1；精密量取1.0 mL對照品儲備液1，置50 mL量瓶中，用乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻，作為對照品儲備液2。
對照品溶液：精密量取1.0 mL對照品儲備液2，置20 mL量瓶中，加嗎啡啉衍生劑0.5 mL，室溫下衍生1 min，加磷酸水溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。
樣品溶液：取0.5 g冰乙酸，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加入嗎啡啉衍生劑0.5 mL，混勻后室溫下衍生1 min，加磷酸水溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，用0.22 μm 針頭式濾膜過濾，取濾液作為樣品溶液。
1.3.2 定量方法
取上述溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰峰面積，然后按照外標(biāo)法計(jì)算樣品中的乙酸酐含量。
2、 結(jié)果與討論
2.1 色譜柱的選擇
分別選擇Waters Atlantis T3柱 和XSelect HSS T3柱兩種色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生產(chǎn)物附近均無干擾峰，說明在相同的測試條件下，選擇T3類色譜柱可滿足測試要求，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇色譜柱。
2.2 色譜條件的篩選
分別考察0.9、1.0、1.1 mL/min 3種流量條件下的分離效果，結(jié)果表明，在不同流量下，除了乙酸酐衍生物的保留時間有變化外，信號響應(yīng)、分離度、拖尾因子和理論板數(shù)等均無明顯變化，故選擇常用流速1.0 mL/min。
考察柱溫分別為25、30、35 ℃時對測定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，隨著柱溫的升高，乙酸酐衍生物的保留時間從17.6 min縮短至15.4 min，變化趨勢不大。當(dāng)柱溫為35 ℃時，目標(biāo)峰與相鄰雜質(zhì)的分離度略有減小；當(dāng)柱溫為25 ℃和30 ℃時，色譜峰峰形對稱，分離良好，拖尾因子為1.0～1.1，理論板數(shù)均大于12 000。由于25 ℃柱溫對實(shí)驗(yàn)室控溫要求較高，因此選擇30 ℃作為最優(yōu)條件。
2.3 衍生條件選擇
2.3.1 衍生反應(yīng)時間
分別選擇在0.5、1、30、60、120、180 min條件下進(jìn)行衍生試驗(yàn)，加標(biāo)樣品中乙酸酐衍生物的峰面積依次為110 623、109 150、107 191、105 742、105 209、108 252，結(jié)果表明在0.5 min內(nèi)衍生反應(yīng)已完全，為方便計(jì)時，反應(yīng)時間選擇1 min。
2.3.2 衍生反應(yīng)溫度
考察衍生反應(yīng)溫度分別為10、25、60 ℃時對衍生反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示加標(biāo)樣品中乙酸酐衍生物的峰面積無明顯變化，說明溫度對衍生反應(yīng)影響不大，為方便操作，選擇室溫作為衍生乙酸酐的反應(yīng)溫度。
2.3.3 衍生劑用量
衍生試劑用量可能會對衍生結(jié)果產(chǎn)生影響，因此評估不同嗎啡啉衍生劑用量（0.05、0.1、0.5、1、2、3.5 mL）對衍生反應(yīng)的效果。測定結(jié)果表明，衍生劑用量不同時，加標(biāo)樣品中乙酸酐衍生物的峰面積無明顯變化，說明當(dāng)衍生劑用量為0.05 mL時，反應(yīng)已完全，為避免較小取樣體積引起的結(jié)果偏差，衍生劑的用量選用0.5 mL。
2.4 色譜圖
在1.2色譜條件下，分別對空白溶液、對照品溶液、樣品溶液及加標(biāo)樣品溶液進(jìn)行測定，4種溶液的高效液相色譜圖見圖1～圖4。由圖1～圖4可知，在空白溶液色譜圖中，目標(biāo)峰附近無干擾峰。在對照品溶液和加標(biāo)樣品溶液色譜圖中，乙酸酐衍生物的保留時間為16.8 min，色譜峰峰形尖銳、對稱，分離良好。
圖1 空白溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of blank solution
t/min
圖2 對照品溶液色譜圖
Fig. 2 Chromatogram of standard solution
t/min
圖3 樣品溶液色譜圖
Fig. 3 Chromatogram of sample solution
t/min
圖4 加標(biāo)樣品溶液色譜圖
Fig. 4 Chromatogram of spiked sample solution
t/min
2.5 線性方程
分別精密量取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL對照品儲備溶液1，置于50 mL量瓶中，用乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻，作為線性儲備液，再按照對照品溶液配制方法分別進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得乙酸酐衍生物系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2色譜條件測定。以線性儲備液中乙酸酐的質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。乙酸酐的質(zhì)量濃度在2.60～25.97 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性方程y=8 093.257 2x-1 860.365 9，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9。
2.6 定量限及檢出限
取對照品儲備液2逐步稀釋至一定濃度后進(jìn)行衍生，按1.2色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰高，當(dāng)乙酸酐衍生物信噪比為10時，得到該方法的定量限濃度為3 μg/mL，當(dāng)乙酸酐衍生物信噪比為3時，得到該方法的檢出限濃度為0.8 μg/mL。
2.7 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)
在冰乙酸樣品中分別加入2.60、6.49、12.98、19.48 μg/mL 4種質(zhì)量濃度水平的乙酸酐溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，進(jìn)行衍生化反應(yīng)后按1.2色譜條件進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，樣品加標(biāo)平均回收率為92.8%～99.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.9%～2.3%(n=6)，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度，滿足實(shí)際樣品的測定要求。
表1 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 1 Sample spiking recovery and precision test results
2.8 溶液穩(wěn)定性
取冰乙酸0.5 g，精密稱定，置于20 mL量瓶中，精密加入12.98 μg/mL的乙酸酐溶液1.0 mL，加入嗎啡啉衍生劑0.5 mL，混勻后室溫下衍生1 min，加入磷酸水溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，分別于室溫下放置0、20、48、72 h后按照1.2色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，衍生產(chǎn)物的色譜峰面積無明顯變化，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%，表明該衍生產(chǎn)物在室溫下放置72 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，在此期間可進(jìn)行進(jìn)一步的定量分析研究。
表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 2 Results of stability test
3、 結(jié)論
由于樣品基質(zhì)成分簡單，干擾較少，測定單一組分乙酸酐衍生物所需時間略長。
理論上，衍生化反應(yīng)溫度、時間和衍生劑的用量對衍生化反應(yīng)均有影響，但單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示反應(yīng)溫度、時間和衍生劑用量對衍生反應(yīng)影響較小，故不再進(jìn)行正交試驗(yàn)篩選最佳反應(yīng)條件。
建立了以嗎啡啉為衍生化試劑，柱前衍生化高效液相色譜測定冰乙酸中微量乙酸酐含量的檢測方法，考察了該方法的精密度、加標(biāo)回收率和定量限，結(jié)果表明該方法精密度高、回收率良好、反應(yīng)條件溫和、基質(zhì)干擾小、成本低且靈敏度高，適用于冰乙酸中乙酸酐的質(zhì)量控制。
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來源：化學(xué)分析計(jì)量
