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本文使用一組已通過生物等效性正式試驗的高變異藥物研究數據，進行上百次模擬生物等效性預試驗，統計主要藥代動力學參數（Cmax、AUC）的幾何平均值和個體內變異系數的概率，據此推測高變異藥物生物等效性預試驗通過的概率。結果顯示，主要藥代動力學參數的幾何均值具有較大的隨機性和不確定性，個體內變異系數受個體受試者數據影響較大。采用兩周期交叉試驗設計開展生物等效性預試驗不能有效地指導高變異藥物制劑處方工藝開發及生物等效性正式試驗。

隨著仿制藥質量和療效一致性評價工作的深入開展，藥物研發機構一般會選擇采用兩周期交叉試驗設計開展生物等效性預試驗研究，為制劑處方工藝開發及正式生物等效性試驗提供數據支持。對于 BCS1 類或 3 類藥物，開展生物等效性預試驗，一定程度上加快了藥物研發進程。而對于高變異藥物（指某些藥物由于生物利用度過低、酸不穩定、吸收前的廣泛代謝等原因，導致一個或多個藥動學參數的個體內變異系數（Within-subject Coefficient of Variation,CVW%）大于或等于 30%。采用兩周期交叉試驗設計法獲得的生物等效性預試驗數據是否能夠有效指導制劑處方工藝開發及正式生物等效性試驗，業內存在較大爭議，主要觀點如下：

（1）為生物等效性試驗樣本量估算提供依據：國家藥品監督管理局（NMPA）、美國食品藥品監督管理局（FDA）[1] 相關指導原則均建議正式試驗開始之前，可在少數志愿者中進行預試驗。預試驗可用于驗證分析方法、評價變異情況、優化采樣時間，并獲得其他相關信息。用于評價變異情況的藥代動力學參數（藥峰濃度 Cmax 和藥物曲線面積 AUC）幾何均值比以及個體內變異系數（CVW%）等，并據此進行研究方案設計，計算合適的受試者例數。

（2）為制劑處方工藝開發參考依據：如沒有建立體內外相關性較強的溶出曲線評價方法的話，可采用生物等效性預試驗評估仿制制劑與參比制劑處方工藝的差異，主要藥代動力學參數（Cmax 和 AUC）幾何均值比以及個體內變異系數（CVW%）如與參比制劑有明顯差異，為制劑處方工藝優化調整提供方向[2]。

（3）完全沒有必要開展生物等效性預試驗：對于高變異藥物，如采用常規的受試者例數（一般為 12 例），個別樣本變異較大，會影響生物等效試驗參數的計算結果，有時即使參比制劑與自身相比較，也可能出現不能證明其生物等效的情況[3]，生物等效性預試驗結果會出現假陽性或假陰性數據。

高變異藥物生物等效試驗的樣本量對于藥物的生物等效試驗非常重要，由于藥物在個體內的變異大，數據的離散程度也就比較大，使用常規樣本來進行生物等效試驗很可能會把生物等效的藥物誤判為不等效的藥物，樣本量過大又涉及到成本和倫理方面的問題，因此對高變異藥物的生物等效的樣本估算是非常重要的，高變異藥物生物等效試驗樣本量估算產生最大影響的主要是參比制劑的 CV 值和受試制劑與參比制劑之間的幾何均值比。

我們參考 Isabel Moreno 等人證明最有效的 12 個受試者單次給藥雙交叉的模擬預試驗設計，按照預試驗的結果來分別計算對正式試驗入組例數估算最重要的兩個因素變異系數 CV 值和幾何均值[4]。尤其通過調查是同一個參比制劑在預試驗中的 CV 值和幾何均值的分布范圍，進而了解如果參比制劑和受試制劑如果在藥學上非常接近，預試驗是否能很好地預測正式試驗的結果和正式試驗需要的受試者例數。同時，也考察對于AUC的變異也超出30%的情形下，預試驗是否能夠很好地預測 AUC 的比值。

有很多專家學者認為預試驗結果中，數據的“單向偏移”（大多數受試者的兩次暴露量的比值均大于或小于 1）可以用來定性的預測受試制劑和參比制劑的暴露量的關系，并應用這個結果來決定是否開展正式生物等效試驗或者用來指導制劑的進一步開發。我們對這樣的一個假設表示懷疑，我們也利用這些數據來模擬計算這樣的假設是否正確。

1、試驗方法

生物等效性試驗數據：某高變異藥物隨機、開放、三周期、部分重復健康成人生物等效性試驗數據，受試者例數42 例。

模擬試驗：采用 DAS 2.0 軟件對生物等效性數據進行計算藥代動力學參數，并進行等效性評價。參考 IsabelMoreno 等人過去采用的方法[4]，在一個已經通過生物等效的高變異藥物的試驗數據中，按照 2×12 的取樣方法來進行模擬的預試驗，采用 Excel 軟件中的函數取隨機號，分別抽取 100 次，每次都計算每一次模擬預試驗取得數據的幾何均值和 CV 值。然后對這 100 次結果的幾何均值和 CV 值的分布進行統計。

2、試驗結果

2.1 用于生物等效性試驗樣本量估計的風險分析

采用兩周期交叉試驗設計法對同一批參比制劑進行生物等效性試驗研究，在 N=42 的條件下，主要藥代動力學參數 Cmax、AUC（0-t）、AUC（0- ∞）幾何均值比值的 90% 置信區間數值符合要求；按照隨機號順序分為 2 組，即N=21 的條件下，出現了第一組（1 ～ 21號）等效，第二組（22 ～ 42）不等效的情形；按照隨機號順序分為 2 組，即N=14 的條件下，三組結果均不等效。因此，采用兩周期交叉試驗進行生物等效性預試驗研究獲得體內變異系數進行正式生物等效性樣本量估計以及臨床研究方案設計，存在較大的風險。

表1 不同樣本量條件下參比制劑藥代動力學參數體內變異系數及90%置信區間統計結果

在采用 2×12 的模擬預試驗的方式進行模擬計算的結果顯示同一個參比制劑其 CVW 值分別在 22.7% ～ 49.7%（R1，Cmax）、17.7% ～ 64.8%(R2，Cmax) 和 17.6% ～ 51.4%（R1，AUC）、19.1% ～ 58.3%（R2，AUC）這樣一個比較寬泛的內波動，統計這些數字在不同區間內出現的頻次見圖 1。從圖可見，CVW 值在 26% ～ 50% 之間的分布相對而言在各個區間沒有太明顯的區別，同一個參比制劑分別按照 R1 和 R2 來進行統計的的結果還是有一定的差異的，這充分的說明了預試驗所取得的CVW 值除了在個別的區間內出現的幾率略高一些外，在很寬的一個范圍內出現的幾率相差并不大。并且，模擬預試驗的計算結果中出現了相當一部分（最少的有 14 次）的 CVW 值是小于 30%的這樣的結果，這進一步提示了我們預試驗的結果很難用于對正式試驗的CVW 值的預測，因此，用這樣的結果來預測正式試驗的例數是不可靠的。

圖1 參比制劑主要藥代動力學參數個體內變異系數概率分布圖

在統計 100 次模擬預試驗所取得的 Cmax 和 AUC 的幾何均值的結果見圖 2、圖 3、圖 4。從圖可見，對于同一參比制劑的 2 次給藥的模擬計算結果而言，無論是 Cmax 還是 AUC 的比值，都分布在一個比較寬的范圍之內，因而，Cmax 和 AUC 即使對于同一個藥物而言，它的幾何均值比在一個比較寬的范圍內普遍分布，單次的預試驗取得的 GMR 的數值的隨機性是比較大的，用來計算正式試驗需要的試驗例數自然也會有很大的隨機性。值得注意的是，這些均值比絕大多數情形下都分布在 0.80 ～ 1.25 之間，這從某個層面也可能證實了采用生物等效標準的范圍為80% ～ 125% 是合理的。

圖2 參比制劑藥代動力學參數（Cmax、AUC）幾何平均值概率分布圖

圖3 參比制劑/受試制劑藥代動力學參數（Cmax）幾何平均值概率分布圖

圖4 參比制劑/受試制劑藥代動力學參數（AUC）幾何平均值概率分布圖

從統計兩次參比制劑和受試制劑的藥代數據的幾何均值的結果中可見，無論是用哪一次參比制劑數據來進行處理，幾何均值比都是隨機出現在 0.86 ～ 1.25 之間非常寬的一個范圍之內，并且會有相當一部分結果超出了1.25 的范圍。因此，單個預試驗的幾何均值比的結果實際上還是在比較大范圍內的一個隨機數，因此用這個數值來計算受試例數，會有很大的風險。

2.2 用于制劑處方工藝開發的風險分析

有很多專家學者認為可以從 BE 預試驗的結果中來定性判斷受試制劑和參比制劑相比的暴露量的相對大小，即預試驗的幾何均值如果大多數情形下 T/R大于 1，或者小于 1 即說明數據有單邊偏向，認為受試制劑的暴露量比參比制劑大或者小，并以此為依據進一步進行制劑的處方和工藝的優化工作。

但是我們從以上的幾個圖表中可以明顯地看到這些幾何均值的分布在一定范圍內的分布是隨機的。因此，預試驗并不能真正體現受試制劑和參比制劑藥物暴露量的相對大小。為了更加準確地說明這個問題，排除由于單個受試者過高或過低的血藥濃度的試驗數據帶來誤差的影響，我們分別統計了每一例受試者的受試制劑和參比制劑的 Cmax和 AUC 的幾何均值的比值的大小，對于在正式的試驗中 Cmax 的幾何均值比 T/R1、T/R2 分別有 24 個受試者和19 個受試者是大于 1，而 AUC 的幾何均值比 T/R1、T/R2 中則分別有 21 例和 15 例受試者大于 1，說明除了 T/R2的 AUC 的比值相對而言有一定的偏向，而其他的數據沒有單邊偏向。我們進一步統計每一次預試驗的結果，統計每一次受試制劑和參比制劑的比值大于 1 或者小于 1 的情形，結果見圖 5 和圖 6，從圖可見每一次模擬預試驗抽取的樣本中，出現受試者使用參比制劑和受試制劑都會出現比較多的“單邊”的現象，100 次中，12 例出現僅出現 3 例受試制劑暴露量超過參比制劑的幾率和出現 9例受試制劑暴露量都超過參比制劑的幾率相差不大。因此，雖然從總體上來看有一定的集中度，但是單次預試驗的結果的隨機性還是比較大，從預試驗中取得的 T/R>1 的數據來分析受試制劑和參比制劑的暴露量的關系也是有很大的風險的，用這樣的結果來指導制劑處方工藝開發存在較大風險。

圖5 參比制劑/受試制劑藥代動力學參數（AUC）幾何均值概率分布圖

圖6 參比制劑/受試制劑藥代動力學參數（Cmax）幾何均值概率分布圖

在實際操作過程中，我們不可能去做多次的預試驗來預測正式試驗的結果以及相關的試驗設計，通過模擬計算發現單次的試驗的 Cmax、AUC 的幾何均值和 CV 值的在一個比較大的范圍內是隨機出現的。而且，通過模擬計算也表明所謂的數據“單向偏移”存在著同樣的概率出現，預試驗的結果也不能給出一個定性的受試制劑和參比制劑暴露量之間的關系的方向。

3、討 論

由于高變異藥物受個體內變異影響較大，通過兩周期交叉試驗設計法生物等效性預試驗對正式試驗樣本量估計以及指導制劑處方工藝開發，存在較大風險，因此不建議采用兩周期交叉試驗設計對高變異藥物進行生物等效性預試驗研究。

由于仿制藥與參比制劑處方工藝存在一定差異，文獻報道數據僅供參考，在制劑處方工藝開發階段及正式生物等效試驗開展前，藥物研發機構最好開展預試驗研究，以降低研究成本及正式生物等效性的風險。在如何高效地進行高變異藥物的生物等效預試驗的研究過程中，可采用重復試驗設計法（部分重復或完全重復）或兩階段設計法。

國家藥品監督管理局發布的《高變異藥物生物等效性研究技術指導原則》[1]，為以藥動學參數為主要終點指標的高變異化學藥物開展生物等效性試驗研究設計、樣本量估算、統計分析、結果報告等方面提供了技術指導，建議采用重復試驗設計（部分重復或完全重復）進行生物等效試驗預試驗，獲得必要的藥代動力學參數，為正式生物等效試驗提供數據支持，設計合理的臨床研究方案，并確定合理的樣本量。

近年來，兩階段設計（Two-StageDesign，TSD）生物等效性研究由于其在樣本量估算方面的適應性、靈活性，已被各國指南所認可（FDA、EMA、加拿大、澳大利亞、日本、新西蘭、WHO 等）[6]。雖然在《中國藥典》9011 藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則中明確指出：“在證明生物等效性時，可以接受兩階段試驗方法，最初一組受試者給藥并分析數據，如果不能證明生物等效，則可以增加招募一組受試者，在最終分析中合并兩組的結果”，制藥企業及藥物研究單位可在生物等效預試驗研究中參考使用。

參考文獻

[1] 美國食品藥品監督管理局，2013，以藥代動力學為終點評價指標的簡化新藥申請的生物等效性研究的指導原則.

[2] 于永沛，閆小妍，姚晨等. 高變異藥生物等效性研究中的樣本量估計 [J]. 中國新 藥雜志，2018,27(9):1019-1024.

[3] 國家藥品監督管理局，2018，高變異藥物生物等效性研究技術指導原則.

[4] Isabel Moreno1,Dolores Ochoa,Manuel Roman, et al. Utility of PilotStudies for Predicting Ratios andIntra-subject Variability in HighVariability Drug[J].Basic & ClinicalPharmacology & Toxicology,2016.

[5] 劉甜甜，陸夢潔，周潼潼等，高變異藥物生物等效性評價確切樣本量計算 [J]. 中國臨床藥理學雜志，2017, 33(6):1152-1156.

[6] 孫華，謝大虎，梁海棠，兩階段生物等效性研究的試驗設計及關注要點 [J]. 藥物評價研究，2017,40(5):593-599.

本文作者劉清梁1,3、王文峰2、鄒江1、楊琰1、張吉喜3*，1華潤雙鶴藥業股份有限公司、2華潤醫藥集團、3重慶大學生物工程學院，僅供交流學習。