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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-02-13 20:19
摘 要： 建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鹿骨膠中阿膠特征多肽含量。樣品經(jīng)酶解、過濾后，采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離，以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液作為流動(dòng)相A，乙腈作為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，在電噴霧離子源正離子模式及多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行掃描檢測，以色譜峰面積為標(biāo)定量。結(jié)果表明，驢源多肽A1、驢源多肽A2的質(zhì)量濃度分別在20.69~517.26、20.48~511.95 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999，樣品的平均加標(biāo)回收率分別為91.4%、99.3%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%、3.0%（n=6）。該方法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，適用于膠類產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞： 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法； 鹿骨膠； 阿膠特征多肽
動(dòng)物膠類藥物在很多疾病的治療和保健中具有重要作用。古籍《五十二病方》記載以膠治療疾病的應(yīng)用[1-2]，《本草拾遺》[3]、《本草綱目》[4]、《本草求真》[5]等許多古籍中也均有以膠類入方治療疾病的記載。近年來，關(guān)于膠類藥物的相關(guān)研究逐漸增多，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。鹿骨膠是通過煎煮和濃縮鹿骨制成的固體膠。其制法為將鹿骨洗凈，浸泡數(shù)日，除盡附著的筋肉，截?cái)啵?jīng)熱堿水處理除去油脂，再洗凈，加水煎煮共計(jì)3次，每次持續(xù)8 h，過濾，將濾液合并，加明礬適量，打循環(huán)攪拌，靜沉，再過濾，將濾液濃縮提抹，加阿膠5%，攪勻，再濃縮成稠膏狀，冷卻后切塊并陰干，即可得到成品。鹿骨膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》十二冊WS3-B-2424-97，檢測項(xiàng)目包括水分、總灰分及重金屬等指標(biāo)。通過檢驗(yàn)項(xiàng)目無法判定鹿骨膠中是否加入了5%的阿膠。由于不同物種蛋白質(zhì)的氨基端序列存在差異，所以可通過鑒別膠原蛋白序列的差異來追溯物種的來源[6]。KUMAZAWA等[7]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對皮革中的膠原蛋白特征多肽進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示只有羊的特征性多肽具有特異性。石峰等[8]利用胰蛋白酶對阿膠樣品進(jìn)行酶解后利用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜對阿膠專屬性特征多肽進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果檢測的10批阿膠樣品均檢出驢皮特征多肽，證明該方法可用于阿膠中驢皮源性成分的鑒別。《中華人民共和國藥典》2020年版一部[9]中收載有阿膠，對阿膠的特征性指標(biāo)-驢源性特征多肽進(jìn)行鑒別。另文獻(xiàn)有報(bào)道用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[10-14]方法，將樣品酶解處理后，檢測膠類產(chǎn)品中的雜皮源成分及投料含量[15-19]。
筆者建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鹿骨膠中阿膠特征多肽含量，根據(jù)測定數(shù)據(jù)計(jì)算出鹿骨膠中阿膠的添加量，適用于鹿骨膠產(chǎn)品及其他含有阿膠成分產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
1、 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：6460 Triple Quad型，安捷倫科技(中國)有限公司。
電子天平：Sartorius CPA225D型，感量為0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)公司。
電熱鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9140MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。
超聲波清洗器：KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限公司。
高速多功能粉碎機(jī)：SL-200型，浙江省永康市松青五金廠。
針式濾膜：PES型，0.22 µm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
超純水系統(tǒng)：SMART-N型，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。
驢源多肽A1對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.5%，批號(hào)為112040-202102，中國食品藥品檢定研究院。
驢源多肽A2對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.3%，批號(hào)為112041-202102，中國食品藥品檢定研究院。
胰蛋白酶：生化級(jí)，批號(hào)為SLCM5418，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。
乙腈：質(zhì)譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
甲酸：色譜純，國藥化學(xué)試劑股份有限公司。
碳酸氫銨：優(yōu)級(jí)純，國藥化學(xué)試劑股份有限公司。
鹿骨膠樣品：山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 色譜儀
色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱[50 mm ×2.1 mm，1.8 µm，安捷倫科技(中國)有限公司]；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 µL；流動(dòng)相：A相為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸，B相為乙腈；洗脫方式：梯度洗脫，流量為0.3 mL/min，洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution program
1.2.2 質(zhì)譜儀
離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；數(shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)；離子源溫度：300 ℃；離子化電壓：4 000 V；壓力：207 kPa。目標(biāo)物的選擇反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表2，理論板數(shù)按驢源多肽A1計(jì)算應(yīng)不小于4 000。
表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)
Tab. 2 Parameters of selective reaction monitor
1.3 溶液制備
1.3.1 樣品溶液的制備
將鹿骨膠樣品使用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，精密稱取粉碎后的樣品粉末0.1 g，置于50 mL容量瓶中，加入40 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸氫銨溶液，使用超聲波清洗器(功率250 W，頻率40 kHz)超聲處理30 min，直至樣品全部溶解，用1%的碳酸氫銨溶液定容，搖勻。精密量取搖勻后的溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加入1 mL胰蛋白酶溶液(取生化級(jí)胰蛋白酶適量，加1%的碳酸氫銨溶液，制成濃度為1 mg/mL的溶液，臨用新制)，再加1%的碳酸氫銨溶液定容，搖勻。將該混合溶液置于設(shè)定溫度為37 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中，恒溫酶解12 h。酶解結(jié)束后，補(bǔ)加液體并搖勻，過0.22 µm聚醚砜濾膜，取續(xù)濾液，得樣品溶液。同法制備空白溶液、陰性樣品溶液。
1.3.2 混合對照儲(chǔ)備液的制備
精密稱取驢源多肽A1、驢源多肽A2對照品適量，加入1%的碳酸氫銨溶液，配制成質(zhì)量濃度為1 µg/mL的混合對照儲(chǔ)備液。
1.3.3 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
用移液管精密量取混合對照儲(chǔ)備液1、2、5、10、20、25 mL分別置于50 mL容量瓶中，加1%的碳酸氫銨溶液定容，配制成質(zhì)量濃度為20、40、100、200、400、500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.3.4 混合對照溶液的制備
精密量取混合對照儲(chǔ)備液10 mL置于50 mL容量瓶中，加入1%碳酸氫銨溶液定容至標(biāo)線，制備得到混合對照溶液。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
分別精密吸取不同濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與樣品溶液各5 µL，在1.2儀器工作條件下，以目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。
2、 結(jié)果與討論
2.1 色譜的優(yōu)化
2.1.1 色譜柱的選擇
分別考察了RSLC 120 C18 (100 mm ×2.1 mm，2.2 μm)、ZORBAX SB C18 (100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)、ZORBAX Eclipse Plus C18 (50 mm ×2.1 mm，1.8 μm)3種不同色譜柱，并比較驢源多肽A1、驢源多肽A2在3種不同色譜柱上的色譜保留情況。結(jié)果表明，RSLC 120 C18柱色譜峰分離效果較差，ZORBAX SB C18和ZORBAX Eclipse Plus C18柱色譜峰對稱性良好，色譜柱系統(tǒng)適用性均符合要求，但在2種色譜柱中驢源多肽A1、驢源多肽A2的色譜峰保留時(shí)間不同，最終選擇保留時(shí)間較短的ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱。
2.1.2 流動(dòng)相的選擇
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用體系中常采用甲酸溶液和乙腈作為流動(dòng)相。甲酸有助于提高檢測靈敏度，減少峰形變形和分裂，提高分離度；乙腈能夠有效分離和洗脫各種化合物，具有優(yōu)良的溶解性能和極性調(diào)節(jié)能力。選擇0.1%甲酸和乙腈作為流動(dòng)相，通過調(diào)整流動(dòng)相比例實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相的優(yōu)化。分別考察了兩種流動(dòng)相比例，分別為0.1%甲酸-乙腈(95∶5，體積比，下同)、0.1%甲酸-乙腈(97∶3)，0.1%甲酸-乙腈(97∶3)理論板數(shù)和分離度明顯高于甲酸-乙腈(95∶5)，因此選擇0.1%甲酸-乙腈(97∶3)作為流動(dòng)相。
2.1.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
驢源多肽A1、驢源多肽A2混合對照品進(jìn)樣檢測，通過一級(jí)全掃描找到驢源多肽A1、驢源多肽A2的母離子，再分別以一級(jí)母離子通過二級(jí)全掃描找到二級(jí)碎片離子，通過不斷優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間以及離子源參數(shù)，使碎片離子響應(yīng)不斷增大，最后確定最適合的質(zhì)譜參數(shù)。
2.2 系統(tǒng)適用性
取對照品溶液，在1.2儀器工作條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次的色譜峰面積。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，驢源多肽A1、A2對照品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.3%、0.9%(n=5)。理論板數(shù)按驢源多肽A1計(jì)算均不小于4 000，分離度均大于1.5，信噪比大于10，表明系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合要求。
表3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 3 Results of system applicability test
2.3 專屬性試驗(yàn)
在1.2儀器工作條件下，分別測定空白溶液、陰性樣品溶液、鹿骨膠樣品溶液、混合對照溶液，色譜圖如圖1所示。從圖1中可以看出，空白溶液、陰性樣品溶液無色譜峰，說明對鹿骨膠樣品中驢源多肽A1、驢源多肽A2色譜峰無干擾。并且鹿骨膠樣品溶液中驢源多肽A1、驢源多肽A2色譜峰及與其他雜峰之間分離度均大于1.5，表明該方法專屬性強(qiáng)。
圖1 空白溶液、陰性樣品溶液、混合對照品溶液、樣品溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of blank solution，negative sample solution，mixed reference solution and sample solution
2.4 線性方程與檢出限
按照1.3.3方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。分別精密吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各5 µL，在1.2儀器工作條件下，以對照品峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出樣品溶液中相當(dāng)于驢源多肽A1和驢源多肽A2的量。質(zhì)量濃度的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限及定量限見表4。
表4 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限及定量限
Tab. 4 Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit
由表4可知，驢源多肽A1、驢源多肽A2的質(zhì)量濃度分別在20.69～517.26、20.48～511.95 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999。
2.5 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)
精密稱取6份同一濃度樣品，分別加入25 µg/mL的驢源多肽A1、驢源多肽A2混合對照溶液1 mL，制成6份加標(biāo)溶液，每份平行測定2次。分別精密吸取不同濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與6份加標(biāo)溶液各5 µL，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算驢源多肽A1和驢源多肽A2的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的準(zhǔn)確度，加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，驢源多肽A1、驢源多肽A2的平均回收率分別為91.4%、99.3%，測定結(jié)果的相對偏差(RSD)分別為1.7%、3.0%(n=6)。表明該方法準(zhǔn)確度良好。
表5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 5 Results of spiked recoveries and precision test
3、 結(jié)語
建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鹿骨膠中阿膠特征多肽含量。優(yōu)化了色譜、質(zhì)譜條件，并分別從系統(tǒng)適用性、專屬性、精密度、準(zhǔn)確度等方面進(jìn)行方法學(xué)研究。該方法準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、檢測靈敏度高，對企業(yè)鹿骨膠產(chǎn)品生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制具有重要作用，同時(shí)也為含有阿膠成分產(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。
參考文獻(xiàn)：
1 馬王堆漢墓帛書整理小組.五十二病方［M］.北京：文物出版社，1979.
Mawangdui Han tomb silk book sorting group，F(xiàn)ifty-two prescriptions for diseases［M］. Beijing：Cultural relics publishing House，1979.
2 朱玲. 《五十二病方》劑型考釋［J］.中藥材，2007，30（12）： 1 613.
ZHU Ling.<Fifty-two prescriptions for diseases> formulation interpretation［J］. Journal of Chinese Medicinal Materials，2007，30（12）： 1 613.
3 （唐）陳藏器，尚志鈞輯校.本草拾遺［M］.蕪湖：皖南醫(yī)學(xué)院科研處，1983.
Tang） CHEN Cangqi，SHANG Zhijun collate. Collect the relics of materia medica［M］. Wuhu：Department of Scientific Research，Wannan Medical College，1983.
4 （明）李時(shí)珍.本草綱目：校點(diǎn)本［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1975.
Ming） LI Shizhen. Compendium of Materia Medica：School point［M］. Beijin：People's Medical Publishing House，1975.
5 （清）黃宮繡著，王淑民校注.本草求真［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，1997.
Qing） HUANG Gongxiu，WANG Shumin Collation and annotation. Herbal medicine seeks truth［M］. Beijing：China Traditional Chinese Medicine Press，1997.
6 陽洪波，王韋達(dá)，李意. 基于特征肽段的液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)鑒定膠原蛋白的物種來源［J］. 分析測試學(xué)報(bào)，2018，37（11）： 1 279.
YANG Hongbao，WANG Weida，LI Yi. Identification of species origin of collagen by liquid chromatography-mass spectrometry based on characteristic peptide segments［J］. Journal of Instrumental Analysis，2018，37（11）： 1 279.
7 KUMAZAWA Y， TAGA Y， IWAI K，et al. A rapid and simple LC-MS method using collagen marker peptidesfor identi?cation of the animal source of leather［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016（64）： 6 051.
8 石峰，，杭寶建，遲連利，等. 驢皮特征肽的發(fā)現(xiàn)及其在阿膠鑒別中的應(yīng)用［J］. 藥物分析雜志，2017，37（12）： 2 272.
SHI Feng，HANG Baojian，CHI Lianli，et al. Discovery of donkey skin characteristic peptide and its application in identification of hide gelatin［J］. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2017，37（12）：2272.
9 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［S］. 1部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020： 197.
10 李明華，龍國友，程顯隆，等. 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法用于中成藥中膠類成分的檢測研究［J］. 中國藥學(xué)雜志，2015，50（24）： 2 151.
LI Minghua，LONG Guoyou，CHENG Xianlong，et al. Ultrahigh performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry for the detection of gum components in proprietary Chinese medicine［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，2015，50（24）： 2 151.
11 程顯隆，陳佳，李明華，等. 特征肽段檢測技術(shù)用于膠類藥材專屬性鑒別方法研究［J］. 中國藥學(xué)雜志，2015，50（2）： 104.
CHENG Xianlong，CHEN Jia，LI Minghua，et al. The characteristic peptide detection technique was used to study the specific identification method of colloidal medicinal materials［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，2015，50（2）： 104.
12 王珊珊，胡娜.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定復(fù)方消痔栓中大黃素［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（3）： 99.
WANG Shanshan，HU Na. Rapid determination of Emodin in Compound Xiaozhi Suppository by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（3）： 99.
13 陳坡，寧霄，曹進(jìn)，等.直接提取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉米酸湯子中米酵菌酸和異米酵菌酸［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（3）： 6.
CHEN Po，NING Xiao，CAO Jin，et al. Determination of bongkrekic acid and isobongkrekic acid in corn sour soup by direct extraction-ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（3）： 6.
14 龍慧端，魯毅翔，張科明.高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定化妝品中24 種香豆素類化合物［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（3）： 37.
LONG Huiduan，LU Yixiang，ZHANG Keming. Determination of 24 coumarin compounds in cosmetics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（3）： 37.
15 陳佳，程顯隆，魏鋒，等. 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測復(fù)方阿膠漿中阿膠［J］. 藥物分析雜志，2015，35（2）： 328.
CHEN Jia，CHENG Xianlong，WEI Feng，et al. Determination of Asini Corii Colla in compound Asini Corii Colla paste by ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2015，35（2）： 328.
16 焦陽，汪冰，周倩倩，等. 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測阿膠中馬皮源成分［J］. 藥物分析雜志，2019，39（5）： 864.
JIAO Yang，WANG Bing，ZHOU Qianqian，et al. Determination of horsehide in Asini Corii Colla by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2019，39（5）： 864.
17 王倩，劉宇文，張杭倩. UHPLC-MS/MS同時(shí)測定鱉甲煎丸中鱉甲膠和阿膠的特征肽含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2022，39（16）： 2 120.
WANG Qian，LIU Yuwen，ZHANG Hangqian，Simultaneous determination of characteristic peptide contents of Biejia Jiao and Asini Corii Colla in Biejia decoction pills by UHPLC-MS/MS［J］. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2022，39（16）： 2 120.
18 杜曉娟，王冰，謝耀軒，等. 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)評(píng)價(jià)當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿膠投料情況［J］. 中國藥學(xué)雜志，2022，57（6）： 413.
DU Xiaojuan，WANG Bing，XIE Yaoxuan，et al. Evaluation of donkey-hide jiao in Angelica Yangxue pills by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，2022，57（6）： 413.
19 黎嘉茗，張萬青，劉瀟瀟. UPLC-QQQ-MS法檢測孕康口服液中驢皮源和牛皮源成分［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2024，33（6）： 43.
LI Jiaming，ZHANG Wangqing，LIU Xiaoxiao，et al. UPLC-QQQ-MS method was used to determine the components of donkey skin and cow skin in Yunkang oral liquid［J］. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2024，33（6）： 43.
引用本文： 余彩娟，劉冊家，楊光霞，等 . 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鹿骨膠中阿膠特征多肽［J］. 化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（11）： 97. (Yu Caijuan, Liu Cejia, Yang Guangxia, et al. Determination of Asini Corii Colla characteristic polypeptides in Deer Bone Gelatin by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 97.)
來源：化學(xué)分析計(jì)量
