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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-04-23 08:33
在日常色譜定量分析中，出現(xiàn)色譜峰形異變或鬼峰，不但嚴重影響定量精度，甚至使分析工作無法進行，本文匯總了各種峰形異變常見類型并加以分析，并給出可能原因，為大家提供一些參考。
出現(xiàn)相同類型的拖尾峰
色譜圖中所有峰拖尾或峰變形通常是由物理作用導(dǎo)致的，而非化學作用。
如果色譜圖中的峰形均表現(xiàn)相同類型的變形（圖2），主要問題發(fā)生在分析物在色譜柱中遷移之前。
圖2. 由于色譜柱篩板部分堵塞或色譜柱塌陷，色譜圖中所有峰形均出現(xiàn)了變形
1、原因剖析：
1、篩板阻塞：柱子兩頭的過濾篩板如果堵塞，樣品就會在篩板部分受阻而形成時間延遲，使得樣品在柱后流出時峰型形成拖尾。需要通過反沖色譜柱，或者更換篩板。
2、色譜柱塌陷：是指色譜柱由于其它原因引起了柱效率喪失，不能對物質(zhì)形成保留，使得物質(zhì)不在固定相上保留而隨流動相流出，但是又還有一點柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色譜柱或者更換色譜柱。
柱頭塌陷原因：
A.由流動相而不是由樣品引起的，因為樣品的進樣量很小，對填料損傷有限，不至于造成那么大量的硅膠基質(zhì)和鍵合相的流失，而流動相的量很大，1.0mL/min的流速，如果pH超標或在色譜柱pH耐受范圍臨界點附近長時間使用，是比較容易造成柱頭塌陷的。
B.硅膠基質(zhì)的溶解規(guī)律是：
a、純水相的流動相中硅膠的溶解度遠大于帶有一定比例有機相的流動相；
b、流動相呈堿性比呈酸性更容易溶解硅膠基質(zhì)，pH>9的時候硅膠溶解顯著；
c、溫度越高硅膠越容易溶解，一般最好控制在40℃以下。
解決辦法：通常無法修復(fù)。
相塌陷：是指常規(guī)C18柱長時間用高含水量的流動相(>90％)長時間沖洗后，導(dǎo)致保留時間逐漸變短，最后可能在色譜柱上一點保留也沒有的現(xiàn)象。
相塌陷原因：
在高含水量的流動相條件下，由于C18長鏈不溶于水，長時間沖洗時，鍵合上去的C18長鏈慢慢的相互聚集形成單獨的一相，水也單獨成一相，因此化合物在流動相的帶動下越來越難與C18長鏈相互作用實現(xiàn)保留，最后一點保留都沒有就直接在死體積的位置被沖洗出來。
解決辦法：色譜柱出現(xiàn)了相塌陷后，通常用純乙腈或甲醇持續(xù)沖洗可以使出現(xiàn)相塌陷的色譜柱恢復(fù)到原來的狀態(tài)，但完全恢復(fù)需要比較長的時間，通常30分鐘到1個小時是必須的。有一種更好的解決辦法是用丙酮做流動相進行沖洗，所需時間更短、效果更好。
3、有污染：即樣品不在同一起跑線起跑，從后面開始跑得到達終點稍晚，表現(xiàn)出拖尾。更換色譜柱或者采用有機溶劑梯度洗脫1h以上，以沖洗柱子。
4、流動相PH值選擇錯誤：如某PH下有的樣品存在分子型和離子型的動態(tài)平衡，離子型的陸續(xù)向分子型轉(zhuǎn)化就會表現(xiàn)出拖尾。調(diào)節(jié)PH值可抑制分子解離，改善拖尾，對于堿性化合物，相對較低的PH值更有利于得到對稱峰。
詳細分析：
玻璃料或柱頭的空隙部分堵塞，此類峰變形最常見的原因是篩板部分堵塞或色譜柱頭塌陷。
除非在推薦的pH范圍之外使用色譜柱，否則現(xiàn)在的柱子基本不會受到空隙的影響。
但是，篩板堵塞仍然是一個普遍存在的問題。對于5μm的色譜柱，入口端的篩板通常具有2.0μm的孔隙度；對于3μm的色譜柱，具有0.5μm的孔隙度。
如果顆粒物來自于樣品，或磨損的泵密封圈或者流動相顆粒物進入色譜，它們通常會聚集在篩板上。
這些顆粒會影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動路徑到達色譜柱，因此會晚于另一部分樣品。
由于此時或此位置未發(fā)生分離，因此所有分析物會以相同的方式被擾亂，進而色譜圖顯示所有峰均具有相似的峰拖尾或變形。
2、解決辦法：
為了防止這一問題的發(fā)生，如果流動相可能含有顆粒（如緩沖沉淀物或灰塵），應(yīng)對其進行過濾，并在泵密封嚴重磨損之前更換新的密封圈。
如果樣品含有顆粒碎片，應(yīng)用0.5μm微孔濾膜對樣品進行過濾或?qū)悠愤M行5min左右的短暫離心，以去除顆粒。
強烈建議在自動進樣器下游安裝0.5μm孔隙度的串聯(lián)過濾器，以過濾任何意外進入HPLC系統(tǒng)的顆粒物。如果串聯(lián)過濾器濾片發(fā)生堵塞，系統(tǒng)背壓會升高；而更換濾片十分簡單、快速和經(jīng)濟。采用串聯(lián)過濾器可顯著延長色譜柱的使用壽命，而且經(jīng)濟實惠。
裂峰或雙峰
原因：
1、樣品或色譜柱污染
2、溶劑效應(yīng)
3、色譜柱過載
3、色譜柱塌陷
4、色譜柱兩個接頭沒有安裝好
5、色譜柱性能下降
6、柱前篩板部分堵塞
如果峰形解析不正確或是未完全分離的重疊峰，可能會被誤認為色譜柱或緩沖液的問題。
如果僅部分解析兩個峰形，則可能會認為其是裂峰或雙峰。如圖3顯示的情形。
圖3. 由于存在第二個組分而產(chǎn)生分裂峰。（a）25ng / mL，和（b）等離子體中10ng/ mL的藥物（第二個峰）（10 ng/mL血漿中的藥物（第二個峰））
在圖3(a)中，可觀察到與圖2極為類似的峰變形，其表明篩板堵塞。
更換色譜柱不能解決此問題，所以篩板堵塞并非導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。如果減少色譜柱上樣品，如圖3(b)，峰形看起來更像是兩個峰，而不是一個肩形峰。
由此進行了進一步的研究，證實了存在第二個峰。調(diào)整方法的條件后，兩個峰完全分離。
伸舌峰
1、樣品過載：被保留的樣品在正常出峰時間前陸續(xù)出來，形成前沿峰。降低樣品含量。
2、樣品溶劑選擇不恰當：當樣品溶劑的洗脫能力大大強于流動相時會出現(xiàn)前沿峰，例如，在反相色譜中用已腈做樣品溶劑，而流動相的洗脫力較弱時會出現(xiàn)前沿峰。選擇流動相或者接近流動相的比例作為樣品溶劑。
3、色譜柱損壞：色譜柱柱效損失，不能對物質(zhì)形成保留。更換色譜柱。
4、在大峰前有小峰出現(xiàn)，假象前沿峰，即大峰前包埋了沒有分開的小峰。調(diào)整流動相洗脫梯度。由于分析方法不適宜導(dǎo)致在主峰前有很多小峰出現(xiàn)，假象前沿峰（非其他因素引起的前沿），大峰包埋了沒有分開的小峰。
解決辦法：優(yōu)化分析方法。
詳細解讀：
伸舌峰一般是色譜柱內(nèi)發(fā)生溝流或色譜柱結(jié)構(gòu)的坍塌導(dǎo)致的。
如果在制造商推薦的條件下使用色譜柱，這種情況則很少發(fā)生。
大多數(shù)硅膠柱在pH2-8的范圍內(nèi)可以保持穩(wěn)定。
pH低于2時，鍵合相會發(fā)生水解；pH高于8時，硅膠會溶解。
如果您需要在此pH范圍以外使用操作HPLC系統(tǒng)，請確保選擇在選定條件下會保持穩(wěn)定的色譜柱。
圖4顯示了因柱過載（色譜柱發(fā)生溝流）導(dǎo)致的伸舌峰。
圖4. 過載導(dǎo)致的伸舌峰。（a）正常的峰形；（b）伸舌峰。
圖4a中顯示了正常的峰形；在約500次進樣后，觀察到伸舌峰（圖4b）。
這種改變是該方法所特有，經(jīng)常在前一次分析結(jié)束后，下一次分析開始時突然發(fā)生。
出現(xiàn)伸舌峰后，唯一有效的解決辦法就是更換色譜柱。
該柱內(nèi)徑為100x2.1mm，柱內(nèi)填充5μm 粒徑的C18填料 。流動相A是10mM碳酸氫銨（pH9.0） ；B是甲醇（MeOH）。
該方法包括5％B等度洗脫段，然后用80%B淋洗。
這種特殊的色譜柱可專門用于高達100％的水流動相，且無封端。
當流動相pH值升高時，封端可保護硅膠免于溶解。
在這種情況下，所使用的色譜柱流動相pH應(yīng)遠高于推薦的范圍，并且無需保護性封端。硅膠在pH為9時會逐漸溶解，直到柱床結(jié)構(gòu)不再穩(wěn)定，并且柱床會發(fā)生移動，產(chǎn)生塌陷或通道，而這又會導(dǎo)致圖4b伸舌峰的形成。
可以使用較低的流動相pH或采用在較高pH下能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)的色譜柱，以避免這一問題。
寬峰
1、色譜柱污染或失效，造成塔板數(shù)降低：更換同樣類型的色譜柱，如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強溶劑沖洗舊柱子。
2、柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大：更換內(nèi)徑較小的短管路。
3、檢測器對反應(yīng)時間或池體積響應(yīng)過大：減少響應(yīng)時間或使用更小的流通池。
來源：Internet
