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嘉峪檢測網 2025-04-23 20:20
摘 要：建立超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定土壤和海洋沉積物中53種農藥和28種抗生素殘留。樣品分別經酸化乙腈（含0.5%甲酸）和Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液（pH 5.0）提取后，利用PRiME HLB固相萃取柱凈化，通過ACQUITY UPLC BEH C18柱分離，在優化的儀器工作條件下測定，用外標法定量。81種化合物的質量濃度在1.0～100.0 μg/L范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均大于0.99，方法定量限為5.0～10.0 μg/kg。81種化合物的加標平均回收率為66.5%～115.5%，測定結果的相對標準偏差為0.3%～15.2%（n=6）。土霉素等4種化合物的基質效應為55.2%～105.2%，基質增強效應較強，強力霉素等5種化合物為中等基質效應，其他化合物均為弱基質效應。該方法可用于同時測定土壤及沉積物中81種農藥和抗生素殘留。
關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜法；土壤；沉積物；農藥；抗生素
為了防治農業生產過程中的病、蟲、草害，提高農作物的生產效率，農藥被廣泛使用，對農、林、牧業的生產發展起到了重要的促進作用。我國是農業大國，農藥的年生產量和使用量均較大[1?2]，單位面積農藥的施用量也很高，約為世界平均水平的2.5倍[3]。長期大規模地使用農藥，以及低效率的使用方式，導致未被利用的農藥持續進入環境，并最終在土壤或者水體沉積物中富集。
抗生素是具有抑制或可殺滅其他微生物的一類天然的或者人工合成的化學物質。抗生素不僅可以用于治療人類疾病，還在畜牧業和養殖業中被大量使用。據2013年統計，我國的抗生素產量接近25萬噸，使用量超過16萬噸，其中52%作為獸用抗生素和促生長劑使用，其余部分則用于人類疾病的治療[4]。人和動物攝入的抗生素能夠被吸收利用的不足30%，絕大多數則以其代謝產物或者原形通過尿液或者糞便排出體外[5]，進入環境，最后在土壤、水體及沉積物中富集。
在土壤和沉積物中不斷富集的農藥和抗生素會直接或者間接對人類的健康產生不利的影響[6?11]。快速、準確地檢測土壤及底泥中的農藥和抗生素殘留水平對科研人員評價其對環境及人類健康的影響有著非常重要的作用。目前常用的測定農藥和抗生素殘留的方法主要有氣相色譜法[12]、氣相色譜-串聯質譜法[13]、高效液相色譜-串聯質譜法[14]等，但由于化合物性質上的差異，很難達到同時檢測多種農藥殘留和抗生素殘留的目的[12?15]。筆者利用通過式固相萃取柱的特點，用兩種不同的提取溶劑提取土壤和沉積物中的目標物，分別通過固相萃取柱進行凈化，再結合部分農藥的性質，使用少量乙腈將小柱中殘留的農藥徹底洗脫，利用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法進行分析，建立了同時測定土壤和海洋沉積物中三嗪類、有機磷類、擬除蟲菊酯類、磺酰脲類、酰胺類等53種農藥，和磺胺類、四環素類、大環內酯類、林克霉素類共28種抗生素含量的方法。該方法在提高檢測靈敏度的同時，極大地提高了檢測效率。
1.實驗部分
1.1主要儀器與試劑
超高效液相色譜-串聯質譜儀：Acquity I Class-XEVO/TQS型，美國沃特世公司。
電子天平：AX622ZH型，感量為0.001 g，美國奧豪斯公司。
臺式冷凍離心機：Sigma 3K15型，德國西格瑪公司。
渦旋混勻儀：MS 3 digital型，德國艾卡公司。
20位固相萃取裝置：美國安捷倫科技有限公司。
乙腈、甲醇、丙酮：均為色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
甲酸：質譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
檸檬酸(C6H8O7·H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2Na2O8·2H2O)：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
81種農藥和抗生素標準物質：純度(質量分數)均大于98%，天津阿爾塔科技有限公司。
超純凈水生產凈水器：membraPure系統，德國曼默博爾公司。
PRiME HLB固相萃取柱：60 mg，3 mL，美國沃特世公司。
針式過濾器：PTFE-Q型，0.22 μm，13 mm，美國安捷倫科技有限公司。
實驗用水為一級水，由membraPure系統制備。
1.2儀器工作條件
1.2.1色譜儀
色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；柱溫：30 ℃；流量：0.3 mL/min；進樣體積：1 μL；運行時間：12 min；流動相：A相為水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈(含0.1%甲酸)；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～1.5 min時A相體積分數為95%，1.5～5.0 min時A相體積分數由95%降至50%，5.0～7.0 min時A相體積分數由50%降至30%，7.0～8.0 min時A相體積分數由30%降至10%，8.0～10.0 min時A相體積分數為10%，10.1～12.0 min時A相體積分數為95%。
1.2.2質譜儀
離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；監測方式：多反應監測(MRM)模式；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：0.5 kV；去溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣：氮氣，體積分數為99.5%，流量為800 L/h；錐孔氣：氮氣，體積分數為99.5%，流量為50 L/h；駐留時間：0.163 s；81種化合物質譜參數見表1。
表181種化合物質譜參數
Tab. 1Mass spectrometry parameters of 81 compounds
注：帶*號的為定量離子。
1.3溶液配制
Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液：向1 000 mL容量
瓶中加入12.9 g C6H8O7·H2O、10.9 g NaHPO4·12H2O和39.2 g C10H14N2Na2O8·2H2O，加入900 mL水溶解，混勻，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至5.0，用水稀釋至1 000 mL，混勻。
混合標準溶液：取53種農藥(表1中序號1～53)和28種抗生素(表1中序號54～81)各10 mg，分別用有機溶劑溶解并定容至10 mL，得到不同種類農藥的標準儲備溶液和不同種類抗生素的標準儲備溶液；分別取上述53種農藥標準儲備溶液各0.1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至標線，配制成質量濃度均為1 μg/mL的53種農藥混合標準溶液；分別取上述28種抗生素標準儲備溶液各0.1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至標線，配制成質量濃度均為1 μg/mL的28種抗生素混合標準溶液。
基質匹配系列混合標準工作溶液：精確吸取一定量的53種農藥混合標準溶液和28種抗生素混標標準液，用空白基質溶液逐級稀釋成81種化合物的質量濃度均分別為1.0、2.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的基質匹配系列混合標準工作溶液。
1.4樣品處理
將土壤樣品置于室內陰涼通風處風干，剔除雜物，研磨后全部通過180 μm (80目)篩網，充分混勻。
稱取2 g (精確至0.01 g)風干后的土壤或沉積物樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入1 mL水，渦旋振蕩30 s后，再加入4 mL乙腈(含0.5%甲酸)，渦旋振蕩30 s，冰浴超聲10 min，以9 500 r/min轉速離心5 min，將上清液全部取出，置于15 mL聚乙烯離心管中備用(上清液1)。
向殘渣中加入5 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液，渦旋振蕩30 s，冰浴超聲10 min，以9 500 r/min轉速離心5 min，準確吸取500 μL上清液，通過PRiME HLB固相萃取柱(上樣前先后用5 mL甲醇和5 mL水預處理)，棄去流出液，用1 mL水淋洗小柱后抽干。
準確吸取500 μL上清液1，通過上述小柱后，再吸取500 μL乙腈(含0.5%甲酸)洗脫小柱，收集所有通過液，混勻，通過0.22 μm針式過濾器，作為樣品溶液。
1.5樣品測定
按照1.4方法處理樣品后，在1.2儀器工作條件下采集數據，利用外標法進行定量分析。
2.結果與討論
2.1提取方法選擇
將2 g土壤樣品用1 mL水進行水化后，用4 mL含0.5%甲酸的乙腈溶液提取目標物，離心后的上清液直接通過PRiME HLB固相萃取柱凈化，結果如圖1所示。由圖1可以看出，待測農藥中除了西瑪津和敵百蟲的回收率大于70%外，其他大多數農藥的回收率均較低，甲氰菊酯、二甲戊靈、對硫磷、毒死蜱、伏殺硫磷、辛硫磷等的回收率均在5%以下，四環素、土霉素、強力霉素、金霉素4種四環素類抗生素的回收率低于30%，其余抗生素的回收率在47.5%至89.2%之間。分析認為，土壤基質中含有的Cu2+，Fe3+，Mg2+等金屬離子可能與四環素類抗生素發生絡合反應，加強了這類抗生素在土壤中的吸附行為[16]，從而使這類抗生素很難被乙腈溶液充分提取。
圖1用乙腈一次提取時目標化合物的平均回收率（n=3）
Fig. 1Average recoveries with one extraction using acetonitrile （n=3）
為了改善四環素類抗生素的回收率，將提取方法調整為兩次提取。第一次提取時，將2 g土壤樣品用1 mL水進行水化后，加入4 mL含0.5%甲酸的乙腈溶液進行提取，離心后將上清液轉移至干凈的試管中。接著用5 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取樣品中被絡合的四環素類抗生素，離心后，取1 mL上清液通過PRiME HLB固相萃取柱，此時水相上清液中的四環素等目標物可保留于小柱的填料中，然后將第一次提取后的高有機相上清液通過小柱，在凈化其中目標物的同時，洗脫小柱上保留的四環素等目標物。兩次提取方式大大改善了四環素類抗生素的回收率，結果如圖2所示。
圖2兩種提取方式時四環素類化合物的平均回收率（n=3）
Fig. 2Average recoveries of ontetracyclines compounds using two extraction methods （n=3）
由圖2可以看出，經過兩次提取后，土霉素、強力霉素、金霉素、四環素的回收率分別為68.8%、70.1%、74.5%、75.8%。值得注意的是，為了避免上機溶液中含有緩沖鹽，應先用乙腈提取，再用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液進行二次提取，通過固相萃取柱的順序則相反，應首先通過第二次提取的緩沖鹽上清液，經水淋洗后，再通過第一次提取的乙腈-水上清液。
2.2凈化方法選擇
兩次提取雖然改善了四環素類抗生素的回收率，但是，農藥回收率低的問題仍然沒有解決。由于大多數農藥的辛醇水分配系數較高，如回收率低于5%的農藥，包括甲氰菊酯、二甲戊靈、對硫磷、毒死蜱、伏殺硫磷、辛硫磷的辛醇水分配系數分別為6.04、5.4、3.83、4.7、4.01、3.38。同時，雖然磺酰脲類農藥在中性條件下的辛醇水分配系數多為負數，但在酸性條件下，其辛醇水分配系數相對較高，比如在中性條件下，甲基二磺隆、嘧苯胺磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、氯嘧磺隆的辛醇水分配系數為-0.48、1.31、-0.59、-1.34，-0.2，而在酸性條件下，這些化合物的辛醇水分配系數分別為1.39、2.02、1.1、0.74、2.5[17?18]。所建立的方法使用的是酸性提取體系，在這種條件下，磺酰脲類農藥更難溶于極性溶劑，這就導致在利用反相萃取材料時，這些辛醇水分配系數較高的農藥更易結合在固相萃取柱的填料上，需要洗脫強度更大的洗脫溶劑才能完全洗脫。PRiME HLB固相萃取柱雖然為直接通過型固相萃取柱，但其原理仍然為反相萃取，辛醇水分配系數較大的農藥在經過80%乙腈-水提取液洗脫后，絕大部分還保留在萃取填料中，因此在兩次提取液分別通過小柱后，增加一次洗脫程序，用含0.5%甲酸的乙腈溶液進行洗脫，測定結果如圖3所示。由圖3可以看出，所有農藥的回收率均在70%和120%之間，表明增加一次洗脫程序，足以將殘留在小柱上的農藥充分洗脫。在優化的提取和洗脫條件下，81種化合物混合加標樣品溶液(20 μg/kg)總離子流圖如圖4所示。
圖3兩次提取結合乙腈洗脫后目標化合物的平均回收率（n=3）
Fig. 3Average recoveries of the target compound after two extraction combined with acetonitrile elution （n=3）
圖481種化合物加標樣品溶液（20 μg/kg）總離子流色譜圖
Fig. 4Total ion chromatogram of 81 compound spiked sample solutions （20 μg/kg）
2.3基質效應
以甲醇為溶劑，配制與基質匹配系列混合標準工作溶液相同質量濃度的溶劑系列混合標準工作溶液。按照1.2儀器工作條件，對溶劑系列混合標
準工作溶液和基質匹配系列混合標準工作溶液同時進行測定，并各自進行線性擬合，分析樣品的基質效應。基質效應(ME)為基質匹配標準曲線斜率減去溶劑標準曲線斜率后，與溶劑標準曲線斜率的比值乘以100%。當基質效應大于0時，為基質增強效應；當基質效應小于0時，為基質抑制效應。當基質效應在-20%和20%之間時，視為弱基質效應；當基質效應為-50%～-20%或20%～50%時，視為中等基質效應；當基質效應小于-50%或大于50%時，視為強基質效應[19?20]。81種化合物的基質效應如圖5所示。
圖581種化合物的基質效應
Fig. 5Matrix effects of 81 compounds
由圖5可以看出，土霉素、金霉素、四環素、紅霉素為強基質增強效應(ME為55.24%～105.19%)；強力霉素、林可霉素和嘧苯胺磺隆為中等增強效應(ME為25.00%～47.22%)；苯磺隆、五氟磺草胺為中等抑制效應(ME分別為-23.43%和-30.25%)，其他化合物以基質抑制效應為主，并且均呈現為弱基質效應(-20%≤ME≤20%)。由于基質效應的存在，在實際檢測過程中，推薦使用空白基質配制基質匹配標準溶液進行定量。
2.4定量限和線性關系
在5.0、10.0 μg/kg加標水平下，每個水平設置6個平行樣品，進行加標回收試驗，考察方法的定量限。將回收率和測定結果的相對標準偏差均達到可接受水平的最低添加濃度作為方法的定量限。結果顯示，當添加水平為5.0 μg/kg時，僅有莠滅凈、撲草凈、西瑪津、三唑磷、二嗪磷5種農藥的回收率為83.2%～103.5%，相對標準偏差為5.6%～12.3%，符合方法定量要求，因此將這5種農藥的定量限確定為5.0 μg/kg。其他48種農藥和28種抗生素在5.0 μg/kg的添加水平下均無法同時滿足準確度和精密度的要求。在10.0 μg/kg添加水平下，81種化合物的回收率均為66.5%～115.5%，相對標準偏差均為0.3%～15.2%，因此將其他48種農藥和28種抗生素的定量限確定為10.0 μg/kg。
在1.2儀器工作條件下分別測定基質匹配系列混合標準工作溶液，以化合物的定量離子色譜峰面積為縱坐標，以基質匹配標準工作溶液中對應的化合物質量濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準工作曲線，進行線性回歸分析。結果表明，81種化合物的質量濃度在1.0～100.0 μg/L范圍內，各線性回歸方程對應的相關系數均大于0.99，說明在此質量濃度范圍內，81種化合物均具有良好的線性關系。
2.5加標回收與精密度試驗
利用空白土壤樣品進行加標回收試驗。按1.4方法平行制備6份加標樣品溶液，在1.2儀器工作條件下分別進行測定，考察方法的準確度和精密度，結果見表2。由表2可知，樣品加標平均回收率為66.5%～115.5%，測定結果的相對標準偏差為0.3%～15.2%，表明該方法的準確度和精密度滿足GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》要求。
表2樣品加標回收與精密度試驗結果(n=6)
Tab. 2Results of samples spiked recovery and precision test (n=6)
3.結語
建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定土壤和海洋沉積物中53種農藥和28種抗生素殘留。選擇酸化乙腈和Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液兩種提取體系對樣品進行提取，利用PRiME HLB固相萃取柱凈化，用含0.5%甲酸的乙腈溶液進行洗脫。該方法符合定量檢測各目標化合物的要求，各化合物的定量限為5.0～10.0 μg/kg，經過基質效應考察，土霉素、金霉素、四環素、紅霉素的基質效應為55.2%～105.2%，顯示出較強的基質增強效應，強力霉素、林可霉素、嘧苯胺磺隆、苯磺隆和五氟磺草胺為中等基質效應，其他化合物均為弱基質效應，因此在實際檢測過程中，推薦使用空白基質配制的標準溶液進行定量。
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引用本文：許炳雯 . 超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定土壤及沉積物中81種農藥和抗生素［J］. 化學分析計量，2025，34（1）： 38.(XU Bingwen. Simultaneous determination of 81 pesticide and antibiotic in soil and sediment by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 38.)
來源：Internet
