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嘉峪檢測網 2025-04-28 08:50
1.概述
國家藥品監督管理局食品藥品審核查驗中心（CFDI）于2025.1.17發布《清潔驗證技術指南》[1]，該指南詳細描述了清潔驗證執行過程中的各項要求，以指導和規范藥品上市許可持有人、藥品生產企業（包括原料藥登記人）等對藥品生產設備及部件的清潔驗證進行科學管理，確保患者用藥安全。眾所周知，藥品生產設備在生產結束后，需按照規定的清潔程序進行清潔。設備上的殘留物必須達到規定的清潔限度要求，才不會對接下來生產的產品造成交叉污染。而確定殘留物是否達到規定的清潔限度要求，離不開對殘留物進行檢驗。因此，建立準確可靠的清潔驗證后殘留物分析方法會對判定設備清潔程度起到舉足輕重的作用。本文筆者將論述清潔驗證后殘留物分析方法開發與驗證要點，以便為廣大研究者在清潔驗證分析方法建立方面提供參考。
2.殘留物分析方法開發
設備表面在生產時會有少量樣品殘留，再經過清洗、清潔，殘留的量會更少，且設備經過清潔后也會有少量的清潔劑殘留。企業一般規定殘留限度為10ppm甚至更低。由于殘留量低，常量分析無法達到，只能采用半微量分析、微量分析甚至痕量分析，所以需要開發滿足需求的檢測方法。如果分析方法選取不當，靈敏度低，殘留量有可能低于檢測限而不易檢出。
2.1 殘留物分類
確定殘留物類型、性質甚至結構是開發殘留物分析方法的基礎和前提，其中，對殘留物進行分類是第一步：按照測試對象可分為中間體、活性成分、輔料和清潔劑；按照殘留物的結構或性質可分為有紫外吸收的化合物和無紫外吸收的化合物。
2.2 分析方法的選擇原則
殘留物分析方法的選擇常遵循四項原則：高靈敏度、盡可能高的取樣回收率、良好的精密度和簡單快速。
2.2.1 高靈敏度：
由于殘留物限度較低，所選擇的分析方法必須有高靈敏度；
2.2.2 盡可能高的取樣回收率：
殘留物分析方法往往存在取樣回收率較低的問題，即使具有同樣的表面殘留量，取樣后樣品的檢測結果也會有很大差異，故《藥品生產驗證指南》規定取樣回收率和方法回收率的綜合回收率不低于50%，多次取樣的回收率的RSD不大于20%，對于回收率的要求較寬松。而實踐中，取樣回收率大約在70%-85%，而RSD一般在5%-15%。建議選擇的分析方法，其取樣回收率在75%以上，RSD不大于10%，盡可能提高分析方法的準確度；
2.2.3 良好的精密度：
樣品取樣回收率較低已經對檢測準確度產生了影響，如果分析方法精密度差，檢測誤差容易產生疊加，產生更大的誤差，這就失去了檢測監控的意義，所以分析方法必須有良好的精密度；
2.2.4 簡單快速：
許多企業都是連續性生產，生產結束后清場、清潔、取樣檢驗，需要很快知道清潔效果和確定是否可以繼續生產下一批產品，這就需要檢驗的及時快速，而這就取決于分析方法是否簡單快速。
此外，分析方法的選擇還應考慮到可用的儀器、檢測技術的專屬性、取樣限制（包括取樣溶劑）、響應值是否呈線性、能否在線檢測、檢驗成本等因素。
2.3 分析方法類型
2.3.1 常用分析方法
常用的分析方法可以分為專屬性方法和非專屬性方法。前者的典型代表為高效液相色譜法，后者的典型代表為總有機碳法。常用的分析方法見表1。
▲表1-常用的分析方法
2.3.2 其他分析方法
除常用的分析方法，基于不同的產品類型，亦可在殘留物分析時采用表2中的方法或表中未列出的其他方法。
▲表2-常見的其他分析方法
2.3.3 微生物和細菌內毒素分析方法
微生物殘留的控制也是清潔驗證的一個重要部分。微生物殘留包括生物負載和細菌內毒素。通常，如果下一個產品質量標準中有細菌內毒素檢查項，應當在清潔驗證中進行該項目的檢測，分析方法通常是藥典方法（藥典四部通則1143[2]）。如不進行細菌內毒素的檢測需要進行科學的評估。
2.4 分析方法的選擇
2.4.1 基于方法的專屬性
分析方法的選擇取決于清潔后的殘留物性質，應當考慮清潔過程中活性成分是否發生變化（如降解）。活性成分如果未發生變化，首選專屬性分析方法；活性成分如果發生變化，則應當選擇專屬性和非專屬性兩個方法。如果只能采用非專屬性分析方法，應當經過充分評估和論證。
基于全生命周期管理的原則，在清潔驗證的不同階段可能使用不同的分析方法來評價殘留物。開發階段早期，可能還未獲得殘留物的足夠信息（例如活性成分是否降解），并且特定的分析方法可能也尚未經過驗證。清潔工藝開發時，可采用電導率、pH或者總有機碳法（TOC）等具有良好耐用性和通用屬性的非專屬性方法，并且這些方法對包括殘留標記物在內的大部分成分也會有響應。
2.4.2 基于殘留物的性質
對于有紫外吸收的化合物，可以采用紫外-可見分光光度法，亦可采用高效液相色譜法。對于單一化合物，分析方法開發時，如果已有該化合物的紫外或高效液相的檢測方法時，可以直接采用，如目標殘留物為活性成分，可直接采用含量測定的方法，但是必須再次實施方法驗證，重點考查檢測限或定量限能否達到要求。如果能夠達到要求，且吸光度滿足準確度驗證的要求，最好采用紫外分光光度法，如果采用高效液相色譜法，方法開發投入的時間會很多，比如色譜柱、流動相類型、流動相的pH值、緩沖鹽濃度的選取等；如果已有的檢測方法的檢測限或定量限無法達到要求，則需調整分析方法或更換其他分析技術，直至靈敏度達到要求，例如，有研究者在開發阿西替尼清潔驗證殘留物分析方法時，其API殘留分析方法借鑒阿西替尼含量測定方法的HPLC色譜條件，在該色譜條件上進行了進樣量的調節、色譜柱的改變、梯度的調整，以及根據清潔驗證擦拭取樣的特點進行了擦拭方法的篩選，最后完成了線性、定量限、檢測限、準確度、精密度和專屬性的驗證，從而建立了符合要求的清潔驗證中阿西替尼殘留分析方法[3]。對于復方制劑，考慮到專屬性，建議優先使用高效液相色譜法。只有一種特例可以使用紫外分光光度法測定，那就是組分之間的吸收峰不互相干擾，吸收波長差異較大，則可以將不同組分在不同波長下分開測定[4]。
對于無紫外吸收的化合物,有以下五種測定方法可供選擇：
（1）采用紫外-可見分光光度法中的比色法。比色法是指供試品本身在紫外- 可見光區沒有強吸收，可加入一定量的顯色劑與供試品反應，使反應產物在紫外或可見光區有強吸收，此過程也稱顯色反應。由于過程是化學過程，顯色劑的選擇至關重要，檢測時還得考慮顯色劑的用量；溶液酸度對顯色反映的影響；反應溫度；反應時間以及反應的可逆性等眾多因素，此外此方法無法對殘留物進行準確定量，所以這種方法一般不被企業所采用。
（2）對待測物進行柱前衍生，以提高其在紫外-可見光區的響應。此方法與上述比色法原理相同，即加入帶有發色基團的衍生試劑與待測物反應，生成穩定的、具有紫外吸收的物質，進而可通過液相色譜法（紫外檢測器）或紫外-可見分光光度法進行檢測。例如，胺類物質常用酰氯類（對甲苯磺酰氯、苯甲酰氯、Fmoc-Cl等）或醛類（苯甲醛、對二甲基苯甲醛等）作為衍生試劑。柱前衍生法雖然可提高待測物的紫外響應，但是存在操作較繁瑣、對反應條件要求高、有可能產生多種衍生化產物，引入其他雜質，給色譜分離帶來困難和有時重現性差的缺點，因此不建議將此法作為優先選項。
（3）對于沸點低、易氣化和熱穩定性好的化合物可采用氣相色譜法。氣相色譜儀的檢測靈敏度可以滿足大多數清潔驗證殘留物質的檢測，限度為2ppm都可以滿足。氣相檢測方法在進行分析方法驗證時，如果采用頂空進樣，需要考慮氣液平衡過程中的基質效應(供試品溶液與對照品溶液組成差異對頂空氣-液平衡的影響)，進行準確度驗證時，可采用標準加入法進行測定，標準加入法可以消除供試品溶液基質與對照品溶液基質不同所致的基質效應的影響。
（4）對于沸點高、難氣化或熱穩定性差的化合物可采用液相色譜串聯其他檢測器法，如ELSD、CAD、MS。其中ELSD和CAD為質量型檢測器，理論上對所有物質均有響應，且這兩種檢測器靈敏度較紫外檢測器更高，而MS的靈敏度和分辨力極高，在痕量物質的檢測方面得到廣泛應用。但以上幾種檢測器的線性范圍較窄，耐用性不如紫外檢測器高，在實際開發方法過程中，可與第二種柱前衍生法對比研究，以選出最適合的方法。
（5）采用TOC法進行測定。TOC法常用來檢測制藥用水中的有機碳總量，用以間接控制水中有機物含量。2005年,FDA提出制藥行業TOC方法檢測清潔后的殘留物是可行的[5]。有研究者用TOC法實現了注射用奧美拉唑鈉清潔后殘留奧美拉唑的測定，他們用標準曲線法定量測定殘留奧美拉唑，結果表明奧美拉唑呈現良好的線性關系，無論是噴淋清潔還是棉簽擦拭清潔后奧美拉唑殘留量均符合要求[5]。然而，此法用于測定殘留物仍有一定的局限性，殘留化合物在水中應具有一定的溶解度，而且測定時需要快速，樣品從取樣到檢測不宜超過30min。另外，樣品須密封保存，防止空氣中CO2的進入而影響測定結果。方法驗證時，線性測試由于受到外部干擾，所以TOC法一般用于限度檢查，對于定量測定還是有一定難度。
3.分析方法驗證
殘留物的分析方法應該在清潔驗證開始之前，即清潔工藝確認前，就完成其自身的分析方法驗證，才能給設備清潔驗證過程殘留物的檢驗和結果的準確判定提供依據。如果引用藥典方法，由于清潔檢測的含量水平較低，其響應值、精密度等指標可能會與藥典方法不同，也應當進行適當項目的驗證。細菌內毒素檢驗方法通常是藥典方法，無需進行方法驗證，確認其適用性即可。對于成分較為復雜產品（如含有螯合劑、表面活性劑等），則需進行細菌內毒素干擾試驗的研究。
清潔驗證的重點之一是確定殘留限度（限度的計算方法詳見《清潔驗證技術指南》中4.5章節，筆者也將在后續文章中分享相關內容，故在此不做贅述），然后使用分析方法測定清潔后設備表面的殘留，分析方法應當經過適當的驗證。分析方法的驗證應按照《中國藥典》的要求進行，通常驗證性能特征有準確度、精密度、專屬性、響應（線性、非線性、多變量）、范圍、范圍下限（定量限、檢測限）和耐用性等，詳見表3。定量限/檢測限必須低于樣品的可接受限度，以確保清潔程序的耐用性。考慮到取樣樣品和檢測間隔有一定時間，還應當評估貯存條件（時間、溫度、貯存的小瓶等）對樣品穩定性的影響。專屬性方法還應關注干擾物（如清潔劑等）可能帶來的影響。值得一提的是，準確度驗證中除了方法本身回收率外，還應包括取樣回收率，如棉簽擦拭回收率、沖洗后不銹鋼板回收率等。
對于使用定性方法來進行清潔驗證時，可不進行全面的分析方法驗證。其準確性和精密度通常只需在殘留限度水平進行，無需進行線性和范圍的驗證。
使用TOC 法測定時，如果結果大于500ppb，需建立線性范圍等證明TOC 方法的適用性。
▲表3-清潔驗證中殘留物分析方法驗證項目
+表示此項特征通常需要評價；-表示此項特征通常不需要評價。
設備清潔殘留物的分析方法經過驗證后，同樣要遵循分析方法生命周期管理的原則[6]，當情況發生改變時要進行再驗證，如分析技術的變更、待分析物的變化、生產工藝的改變或清潔工藝的改變等，都可能影響原分析方法確定待分析物水平的準確性，分析方法也需要隨之進行部分或完全再驗證[7]。
4.結語
本文筆者以《清潔驗證技術指南》為基礎，結合其他文獻，總結了清潔驗證后殘留物分析方法開發與驗證要點，為廣大同行提供思路。生產設備清潔程度的判定離不開準確可靠的殘留物分析方法，建立持續可行的清潔驗證殘留物分析方法，將為生產工藝持續高效運轉提供堅實保障。
參考文獻
[1] CFDI：《清潔驗證技術指南》.
[2]《中國藥典》四部通則1143細菌內毒素檢查法.
[3] 賀佩蘭. 阿西替尼及其清潔驗證中殘留物的HPLC分析方法研究[D]. 浙江工業大學，2019.
[4] 管玉華，徐春明. 藥品清潔驗證中殘留物檢測的分析方法選擇[J]. 中國醫療前沿，2013, 8(22): 92-92, 96.
[5] 李明，曲楠楠，董春柳. TOC分析方法在制藥設備清潔驗證中的應用舉例[J]. 生物技術世界，2016, (2): 201.
[6] ICH Q2(R2): Validation of Analytical Procedures.
[7] 陳雯秋. 清潔驗證中的分析方法學驗證[J]. 中國藥業雜志，2005, 14(4): 17-19.
來源：注冊圈
