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嘉峪檢測網 2019-02-14 11:24
摘要：
目的：對微小核糖核酸122（microRNA-122）的定量檢測技術進行評估，探討其臨床應用價值。
方法：采用miRFLP技術檢測企業校準品、參考品和臨床樣本，評價該技術的分析性能與臨床檢測價值。
結果：該方法定量下限為183 copies/μL，檢測標準曲線183~1500000 copies/μL。高濃度平均回收率113.2%，低濃度平均回收率94.2%，比例系統誤差為3.7%。人間精密度變異系數4.2%~1.3%；室間精密度變異系數6.4%~2.5%；批間精密度變異系數4.0%~1.5%；批內精密度變異系數4.1%~1.7%。試劑盒放置4℃ 12小時后的檢測結果與預期靶值無明顯差異。采集化療后24小時內43例腫瘤化療患者的血樣，并分離血漿進行miRNA-122檢測，將檢測結果與現行診斷標準進行ROC方法學分析，CutOff值設定為14136copies/μL，與歐盟公布的PSHT HV健康志愿組（歐洲人群）miRNA-122的13356 copies/μL（95%）基本一致。
結論：基于miRNA的微小核糖核酸（miRNA-122）定量檢測技術具有性能優良、準確度高、穩定性好等優點，有較高的臨床應用價值。
微小核糖核酸是一類由19~22個核苷酸組成的非編碼RNA，主要參與調節各種基因表達，如直接結合到mRNA的抑制或啟動子區域將抑制或者促進轉錄基因的翻譯。由于具有早期和精確診斷的應用前景，檢測人體體液（包括血液、唾液、尿液和房水）中的miRNA早已受到關注。疾病相關miRNA的探索篩選工作也在不同的疾病領域得到廣泛應用。miRNA被脂質或脂蛋白復合物包裹以一種相對穩定的形式進行體內循環，因而可以作為穩定的生物標志物被檢測。美國FDA科學家Shi Q在2013年撰文深入論述了血液microRNA，尤其是miRNA -122作為肝損害生物學指標，具有顯著優于傳統標志物（ALT）的臨床應用前景，但也存在無標準化的定量檢測方法的問題。美國FDA在2015年8月20日發布了有關生物標志物的報告，認定miRNA-122作為臨床亟需（Critical Need）的急性肝毒性安全生物標志物（非臨床和臨床），可應用于藥物肝臟毒性的證明性研究、臨床劑量遞增的安全性研究及藥物誘發的肝損傷3種情況。
同時，美國FDA科學家Shi Q再次撰文論述了miRNA作為臨床生物標志物的發展受制于缺少標準化定量檢測方法，并引用了一種免提取PCR-熒光毛細管電泳法技術，來闡述如何建立定量檢測方法，并認為這是一種創新的檢測方法。
以往的工作中，利用一種免提取PCR-熒光毛細管電泳法技術，也稱作miRNA來源的片段長度多態性技術（miRFLP），通過免提取RNA技術可實現微量血漿和房水樣本（低至1 μL）的定量檢測。本文基于miRNA方法對微小核糖核酸122（miRNA-122）定量檢測的定量下限、標準曲線、回收率、精密度進行評估，并應用該技術對臨床腫瘤化療患者的血漿樣本進行了檢測和驗證。
1 材料與方法
1.1 樣本
本研究根據《赫爾辛基宣言》和《議定書》進行。四川省腫瘤醫院倫理審查委員會批準。使用EDTA-NA2采血管抽取四川省腫瘤醫院接受化療治療的患者5 mL全血，采用800 g離心力離心10 min，取上層淡黃色液體轉移至1.5 mL離心管并立即置于-20 ℃保存。總共收集43例腫瘤化療患者血樣。企業校準品、參考品由成都諾恩基因科技有限公司提供。
1.2 儀器與試劑
儀器：Analytikjena PowerCycler pcr儀，VeritiTM PCR儀和ABI 3730 XL測序儀。
主要材料：Triton X-114（Sigma-Aldrich），Potassium chloride（Sigma-Aldrich），RT buffer（Takara），Magnesium sulphate（Sigma-Aldrich），dNTP（Sigma-Aldrich），MMLV reverse transcriptase（RT，Takara），RNase Inhibitor（RI，NewEngland Biolabs），PCR buffer（Sigma-Aldrich），JumpStart Taq DNAse（Sigma-Aldrich），MyOne Streptavidin C1（Life technologies），Ribonuclease A（RNase A，Takara），RNA序列、cDNA引物、PCR引物和生物素標記歐米伽引物（南京金斯瑞生物科技有限公司產品）。
1.3 基于miRNA的微小核糖核酸122（miRNA -122）定量檢測技術
取5 μ L血漿樣本加入3 5 μ L樣本釋放劑（Triton X-114、氯化鉀、逆轉錄酶緩沖液、硫酸鎂、無核酸酶水），4 ℃ 10分鐘，75 ℃ 3分鐘，充分裂解包裹miRNA的外泌體，取8 μL裂解好的血漿分別加入1 μL內對照、2 μL miRNA歐米伽探針和2 μL內對照歐米伽探針，55 ℃ 5分鐘，1個循環；55 ℃ 1分鐘、20 ℃ 1分鐘，10個循環進行雜交。交后加入4 μL逆轉錄反應液（dNTP、逆轉錄酶、鼠源RNA酶抑制劑）在37 ℃ 5分鐘，1個循環；55 ℃ 15秒、4 ℃ 1分鐘、20 ℃ 1分鐘、37 ℃ 30秒，40個循環；85 ℃ 5分鐘，1個循環條件下進行逆轉錄反應。逆轉錄反應后加入60 μL cDNA延伸反應液[miR-122cDNA延伸引物、2×PCR buffer、dNTP、內對照cDNA延伸引物、TaqDNA聚合酶、硫酸鎂、核糖核酸酶（牛胰）、無核酸酶水]在95 ℃ 2分鐘、60 ℃ 10分鐘，1個循環；72 ℃ 1分鐘、37 ℃ 3分鐘，20個循環；72 ℃ 5分鐘、95 ℃ 1分鐘，1個循環條件下進行cDNA延長反應。反應后，加入磁珠（C1）進行純化，用清洗液和無核酸酶水清洗，清洗后，進行PCR擴增。加入30 μL PCR反應液（PCR擴增正向引物、PCR擴增反向引物、硫酸鎂、2×PCR buffer、dNTP），在95℃ 2分鐘、55℃ 10分鐘，1個循環；37℃ 3分鐘、55℃ 1分鐘，10個循環；72℃ 1分鐘，1個循環；95℃ 30秒、68℃ 3分鐘、72℃ 30秒，45個循環；72℃ 10分鐘，1個循環，60℃ 4小時，1個循環條件下，所有PCR擴增模板進行競爭性同步擴增，完成miRFLP的反應步驟。將得到的PCR產物用10×TE（pH 7.0）進行1:100的稀釋，采用熒光毛細管電泳ABI3730檢測。
1.4 性能評估
技術性能評估實驗設計參考《美國臨床實驗室標準化協會批準指南》（CLSI-EP）、《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》 和美國Roche公司的關于COBAS®6800/8800系統對HIV-1核酸定量檢測的性能評估。
1.4.1 精密度
在相同條件下（方法、試劑、儀器、參考品、實驗室、操作員）對高、低兩個濃度（3.44、5.12 Log10 copies/μL）水平的樣本進行檢測，每個樣本每日2個批次，每個批次測8次，共檢測5日，得到80個數據。從每個樣本10個批次中每批的8次變異系數算出批內精密度。從每個樣本的80個結果計算出批間精密度。不同實驗員在相同條件下（方法、試劑、儀器、參考品、實驗室）對高、低兩個濃度水平的樣本進行檢測，每個樣本各進行16次重復檢測，計算得到人間精密度；成都諾恩基因科技有限公司在相同條件下（方法、試劑、參考品）對高、低兩個濃度水平的樣本進行檢測，每個樣本各進行16次重復檢測，計算得到室間精密度。
1.4.2 檢測限
將樣本稀釋成接近于方法標準曲線低限濃度水平的3個濃度樣本（1：366 copies/μL、2：183 copies/μL、3：92 copies/μL），將3個濃度樣本各進行20次重復測定。
1.4.3 標準曲線
準備13個不同濃度（1500000、375000、187500、93750、46875、23438、11719、5859、2930、1465、732、366、183 copies/μL）的樣本進行檢測。對檢測結果和理論濃度進行多項式回歸，得到相關系數R2。
1.4.4 回收率
以樣本（1465 copies/μL）為標準樣本，分別制備48220、28932 copies/μL的待加入樣本。制備6份相同體積的待測物標準樣本。每2份中加入同一濃度待加入樣本，制成2個不同待加入濃度的回收樣本，計算加入的待測物濃度。在2份樣本中加入同樣量的無被測物的樣本稀釋液，制成基礎樣本。分別對回收樣本、基礎樣本和低濃度樣本進行3次重復測定，取其均值進行計算。
1.4.5 臨床樣本檢測
單點采集化療后24小時內43例腫瘤化療患者的血樣，并分離血漿進行miRNA-122檢測，同時參照2015版《藥物性肝損傷診治指南》進行miRNA-122與現行診斷標準的ROC分析。現行診斷標準采用Roussel Uclaf因果關系評估法（RUCAM）。
2 結果
2.1 精密度
精密度結果見表 1。
表 1 精密度檢測結果
依據技術要求，該技術可以準確地檢測miRNA-122，具有很好的穩定性。
2.2 檢測限
結果顯示，濃度為366 copies/μL時檢出率是100%，濃度為183 copies/μL時檢出率是95%，濃度為92 copies/μL時檢出率是75%。依據技術要求，該技術定量下限為183 copies/μL。
2.3 標準曲線
標準曲線結果見圖 1，結合前面檢測限實驗結果，標準曲線為183~1500000 copies/μL。結果表明，該技術具有較寬的標準曲線，適于臨床低濃度樣本的檢測。
圖 1 標準曲線檢測結果
2.4 回收率
回收率結果見表 2。
表 2 回收率實驗結果
實驗結果顯示，高濃度平均回收率為113.2%，低濃度平均回收率為94.2%，比例系統誤差為3.7%。依據技術要求，該技術具有很好的準確性。
2.5 臨床樣本檢測
在現行診斷標準（ALT、R值）能夠診斷的病例中，以現行診斷標準（ALT、R值）為參照，對比miRNA-122的ROC分析（見圖 2）。miRNA-122與現行診斷標準（ALT、R值）具有較高的一致性，其AUC、P值、特異性及靈敏度均滿足臨床需求，初步確定的CutOff值設定為14136 copies/μL，該值與歐盟2016年9月30日公布的PSHT HV健康志愿組（歐洲人群）miRNA-122的13356 copies/μL（95%）基本一致。
圖 2 miRNA-122ROC分析圖
3 討論
血液中miRNA的檢測技術平臺主要有Northern blotting法、微陣列芯片法、RTqPCR。但Northern blotting法靈敏度低、耗時長；微陣列芯片法穩定性和重復性差，無法實現定量檢測；RT-qPCR是最為廣泛應用的檢測技術，但該方法需要提取總RNA后再進行檢測，樣本需求量大，同時還需要找到內源性參考物來估量提取過程靶標的損失，限制了它在臨床診斷中的應用。
肝損傷評估最直觀的是病理形態學診斷方法，但手術禁忌癥多，只能反應局部的變化，不能反應出肝臟整體的情況。而miRNA-122具有更好的靈敏度和特異性、更小的個體間差異，潛在的分辨致命與非致命性肝損傷的能力以及反映肝損傷模式甚至病因學的能力。因此，miRNA-122具有肝損傷最佳標志物的前景。本研究基于miRFLP的方法對微小核糖核酸122（miRNA-122）進行定量檢測。該技術具有很好的穩定性、重復性、準確性和較寬的檢測范圍，適用于低濃度樣本的檢測，可用于自動化分析，操作簡單，使用方便，各項檢測性能均可滿足臨床檢測要求，為臨床評估肝損傷提供了一種新的方法，適用于腫瘤患者化療過程中肝臟損傷的實時監測，以及人體肝臟其他損傷情況的實時檢測。該方法應用范圍廣泛，具有極高的臨床應用價值。
作者：游延軍, 陳蕊, 蒲小聰, 彭靈犀, 胡澤斌, 高飛
來源：中國藥事
