天堂网www,免费追剧大全在线观看电视剧,97久久精品无码一区二区欧美人 ,日本丰满少妇高潮呻吟

摘  要 / Abstract

本文對脫氧核糖核酸(DNA)分子鑒定技術的概念與內涵，及其目前在中藥標準的應用情況作了較為詳細的介紹；提出目前存在的主要問題是標準少、標準方法的執行力度弱，以及缺少分子生物學技術專門人才。本文認為解決這些問題的根本措施在于加強DNA分子鑒定技術相關人才隊伍建設。

This article introduces the concept and content of deoxyribonucleic acid (DNA) molecular techniques and their application in the authentication of traditional Chinese medicine (TCM).The authors point out that the main problems with DNA molecular techniques are the lack of standard methods and insufficient implementation of those standards,and more fundamentally the lack of qualified technician.Therefore,strengthening the training and cultivation of technicians skilled in DNA molecular techniques is the key to solving these problems.

關 鍵 詞 / Key words  中藥; 鑒定; DNA 分子鑒定技術; 中藥標準

traditional Chinese medicine; identification; DNA molecular techniques; standards for traditional Chinese medicine

01、前    言

自2010年版一部《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)首次收錄蘄蛇和烏梢蛇兩個品種的聚合酶鏈式反應(PCR)鑒別法，至今DNA分子鑒定技術在中藥標準中的應用已有十多年歷史[1-2]。最新的《中國藥典》2020年版一部中共收錄了動物藥3個品種、植物藥2個品種的DNA分子鑒定技術相關方法，以及中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則[3-5]。十年來該技術的應用在曲折中前進：至今多數藥檢系統人員對這一技術仍然不熟悉或缺乏正確認識，相關的檢驗業務尚未開展，缺少獨立的分子生物學實驗室。在標準研究和標準執行兩個層面，都存在明顯的“躲避”和“疲軟”狀態。如何加快推進DNA分子鑒定技術在中藥檢定中的應用，是值得我們思考的問題。

02、DNA 分子鑒定技術介紹

脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)是生命體的遺傳物質，是生物的設計藍圖，據此構建細胞內的分子，指導下游核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和蛋白質的合成。以蛋白質為核心的生物合成工廠，每時每刻都在合成著生命功能所需的各種物質，這種合成隨著時間、空間(生命體的不同部位)、環境等因素的變化而變化。DNA作為生命活動的總司令，對同一生命體而言，不會隨著外在因素的變化而變化，是比較固化的物種特征，其差異主要存在于不同的物種之間。因此，可以根據DNA序列的差異，進行物種鑒定或鑒別；與之相關的技術，即DNA分子鑒定技術。

中藥DNA分子鑒定，即常說的中藥分子鑒定，黃璐琦院士團隊將其列為分子生藥學的一個分支學科[1]。從廣義上來講，中藥分子鑒定與DNA分子鑒定并不等同。因為“分子”可以是DNA，也可以是蛋白質或小分子化合物。所以所謂分子鑒定，既可以指DNA水平的鑒定，又可以包括蛋白質水平或小分子化合物水平的鑒定。但是從名詞使用習慣來看，中藥分子鑒定一般指代的就是DNA分子鑒定。而PCR作為非常重要的分子生物學技術手段，也常常被用來指代DNA分子鑒定技術。然而需要明確的是，中藥分子鑒定、DNA分子鑒定以及PCR三者的含義嚴格來講是不同的(圖1)。

DNA作為遺傳信息的直接載體，具有信息量大、遺傳穩定性高、化學穩定性強等特點。PCR發展至今已經是很成熟的技術，操作簡便快捷，應用也頗為廣泛，幾乎滲透到生命科學領域的各個方面。例如在新冠病毒核酸檢測中，應用PCR相關技術可以在短時間內完成對大量樣本的快速篩查；由于不需要昂貴的大型檢測儀器及檢測成本低廉，第三方檢測機構和地區醫院也紛紛建立檢測實驗室，為疫情防控做出了重要貢獻。在中藥鑒定領域，DNA分子鑒定技術在易混淆品種、瀕危珍貴動植物藥材、破碎藥材、陳舊藥材、考古出土中藥珍貴樣品的鑒定、藥材摻偽鑒定、含中藥原形的中成藥鑒定(丸劑、散劑等)等方面具有十分突出的技術優勢，解決了傳統鑒別中的諸多難點問題，展示了良好的應用前景[6-9]。

目前中藥鑒別檢驗中比較常用的是薄層色譜法，與之相比較，DNA分子鑒定法的優勢在于：直接將物種區別的本源——遺傳物質作為檢測靶標，因而專屬性更強；對于不同藥材品種的檢測，反應中所需的緩沖液具有通用性，并且高度商品化，使用方便；方法的反應條件相對固定，一般不需要自行調整，易于標準化操作；不會受外界環境如溫濕度的干擾，檢測結果更加穩定；所用毒性試劑少，環境友好等[10-13]。然而《中國藥典》收錄的近千個中藥材品種中，只有寥寥幾個品種項下收錄了DNA分子鑒定方法；由此可見該技術在中藥檢驗中的普及應用是遠遠不夠的[3-4]。

按照基本原理不同，目前常用的中藥DNA分子鑒定技術可分為位點特異性PCR技術和DNA測序技術。

位點特異性PCR技術，是指使用具有種屬特異性的引物進行PCR擴增，只有目的物種可檢測到擴增產物。根據檢測手段的不同，該技術又可分為傳統的PCR技術和熒光定量PCR技術。前者通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產物的存在與否，只可以進行定性判斷；后者通過熒光信號來反應PCR產物的有無和多少，既可定性又能定量[14-16]。

DNA測序技術是指借助于測序儀器對DNA序列進行解讀。該方法的優勢在于可以獲得特定DNA片段的真實序列信息，進而通過DNA序列的比較分析得出物種鑒定或種屬鑒別結論。目前測序技術已經非常成熟，測序結果直觀確切，信息量大，在中藥檢驗和標準研究中不可或缺，應大力推廣[5,8]。

根據測序通量的不同，可分為一代Sanger測序和高通量測序。前者測序周期短，成本低，準確性高，應用更為普遍；后者對于測序樣本的質量要求較高，測序前需要先建庫，周期長，成本較高，主要可用于標準研究前期鑒別標記的尋找，一般不宜直接作為檢測方法應用。

03、DNA 分子鑒定技術在中藥標準中的應用情況

目前，《中國藥典》2020年版一部收錄的相關標準方法有動物藥蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇飲片【鑒別】項下PCR法，植物藥川貝母、霍山石斛【鑒別】項下聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法(表1)。在《中國藥典》四部通則中，收錄了《中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則》[3-4]。此外，九味羌活丸等幾個中成藥品種的水稻源性成份檢查法近日也納入了國家藥品監督管理局補充檢驗方法。

三種蛇類藥材都是采用PCR鑒別方法，即通過將正品與常見偽品的DNA序列比對，設計正品特異性擴增引物。結果中正品應有單一擴增條帶，偽品則應無擴增條帶出現。該類方法在《中國藥典》中的出現，改變了以往僅靠性狀特征進行鑒別的狀況。事實上，有些不同種類的蛇看起來比較相似，而加工成小段的飲片就更增加了性狀鑒別的難度。比如，烏梢蛇的顏色和形態與灰鼠蛇很相近，沒有一定的經驗很難分辨；通過PCR方法，只需按照規定步驟操作，烏梢蛇可以出現單一的陽性條帶，而灰鼠蛇對應位置沒有條帶，從而非常明確的區分二者。

川貝母PCR-RFLP鑒別法是首個被《中國藥典》收錄的植物藥DNA分子鑒定方法[3-4,17-18]。川貝母是多基原藥材，來源于6種同屬的百合科草本植物的鱗莖，分別是川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母和瓦布貝母。按照性狀不同，又可分為松貝、青貝、爐貝和栽培品。由于川貝母藥材本身性狀變異就很大，同屬植物的鱗莖在外觀上與川貝母的有些種類又很相像，所以一直以來靠性狀鑒別判定是否川貝母正品非常困難。川貝母與其他貝母在市場價格上相差懸殊，因此偽品冒充的現象也屢見不鮮，如小平貝冒充松貝，伊犁貝母冒充太白貝母，新疆貝母冒充青貝等。《中國藥典》自2010年版第一增補本起，收錄了川貝母PCR-RFLP鑒別法。該方法是基于川貝母ITS1區域存在一個獨特的限制性內切酶位點SmaⅠ，可以將擴增片段切割，從而在瓊脂糖凝膠電泳圖上形成兩條位于100～250bp之間的條帶；常見偽品不能被SmaⅠ切割，所以在結果圖上只有1條條帶。如此檢測人員只需按照標準操作流程和規范，就能將川貝母正品與偽品客觀的區分開來。這一國家標準的頒布，使得多基原藥材川貝母的鑒別檢驗水平有了質的飛躍，對川貝母藥材市場的影響也頗為突出。從持續進行的川貝母委托檢驗和抽驗工作中可以看出，近幾年的檢驗不合格率顯著降低，表明川貝母偽品泛濫的狀況得到了有效控制。

霍山石斛是《中國藥典》2020年版一部新收錄的品種，其鑒別項下也包括了PCR-RFLP鑒別法。與川貝母PCR-RFLP鑒別法不同的是，只有當PCR產物條帶不能被切割時，即瓊脂糖凝膠電泳圖上為單一條帶，才能判定為正品霍山石斛[3]。

此外，隨著DNA條形碼分子鑒定技術在中藥鑒定中的應用研究越來越成熟，《中國藥典》自2010年版第三增補本起收錄了《中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則》(以下稱《指導原則》)?！吨笇г瓌t》通過對大樣本量中藥材進行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心，psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI為主、ITS2為輔的動物類藥材DNA條形碼鑒定體系。DNA條形碼鑒定法的出現，使得中藥材的鑒定結果更加明確，不僅可以鑒定真偽，對很多藥材品種還能鑒定基原。由于擴增和測序采用的是通用引物，不必對每一種藥材進行專門的引物設計，方法具有一定的通用性。另外，該鑒定法的有效應用取決于數據準確、可及的DNA序列信息數據庫，或者經過準確基原鑒定的樣本。目前可供公眾使用的數據庫主要有美國國立衛生研究院(NIH)管理下的NCBI核酸數據庫，該庫包羅了多種生物的基因信息，比較龐雜；面向公眾開放，可自由上傳或者下載序列信息，因此其中不可避免會存在錯誤的信息。由陳士林教授團隊建設的中藥材DNA條形碼鑒定系統，是目前相對比較全面的專門針對中藥材的DNA信息數據庫，但尚未對外公開使用。法定檢驗需要的是一個數據準確、來源可追溯，兼具查詢比對、結果合理輸出等功能的DNA標準序列信息數據庫。在標準數據庫尚不具備的情況下，運用DNA條形碼技術進行中藥鑒定時，可以采取數據庫查詢比對與標準藥材樣本DNA序列比對相結合的方式，從而最大程度保證鑒定結果的正確性。

盡管現階段熒光定量PCR方法在中藥檢測中的實際應用還不是很普遍，但是隨著中藥質量控制技術方法的不斷進步，未來應該有廣闊的發展空間[20-22]。熒光定量PCR法可分為探針法和染料法，其中探針法的特異性、靈敏度和重復性都明顯優于染料法，且能夠應用于多種藥材混雜的情況，在中藥材和飲片摻偽檢測中有很好的應用前景[21]。此外對于DNA含量較少(如牛黃類藥材)或者由于深度加工處理導致DNA片段化嚴重的藥材(如膠類藥材)、配方顆粒和成方制劑等，都可以嘗試建立基于熒光定量PCR探針技術的檢測方法[11,22]。如擬定的補充檢驗方法“培植牛黃中豬源性成份檢查方法”，基于特異性的豬探針引物，采用TaqMan探針技術對培植牛黃中可能的摻偽成份——豬源性成份進行定性檢測，具有專屬性強，靈敏度高，重復性好的特點。熒光定量PCR方法具有定性和定量的雙重作用，可以有效解決目前存在較為普遍的中藥材和飲片摻偽問題，具有良好的應用前景。

04、存在的主要問題及解決策略

生物技術是生命科學各個領域都必不可少的技術，在中藥質量控制中同樣不可或缺[23-25]。然而由于中藥DNA分子鑒定方法在法定檢驗中的應用研究起步較晚，目前的應用還不是很廣泛，并且多數《中國藥典》藥材與飲片品種項下尚無相關方法。另一方面，由于對該技術的了解和掌握不足，導致已有的標準方法在實際應用中的執行力度不夠。例如，于2017年面向全國檢驗機構開展了川貝母PCR-RFLP鑒別法能力驗證活動，最后只有50多家單位參加，而且通過率不足60%；這與其他檢驗方法的能力驗證相比，無論參加單位數量還是通過率方面，都是比較低的。川貝母PCR-RFLP鑒別法從《中國藥典》2010年版第三增補本就開始收錄，然而到了2017年多數檢驗機構仍然對這一方法不夠熟悉。由此可見，如何推廣普及現有的標準方法以及建立更多的相關標準，充分發揮技術優勢，從而更好地服務于中藥質量控制，是迫在眉睫的問題。

面對上述問題，建議：首先，應重視和加強標準建設，加快推進中藥DNA分子鑒定方法相關的標準研究，同時注重標準研究的規范性，從而建立更多行之有效的中藥分子鑒定標準方法。這其中，應尤其重視法定DNA條形碼信息數據庫建設及相關鑒定軟件的開發，使得通用高效的DNA條形碼鑒定技術真正服務于中藥日常檢定工作[26-27]。

其次，應加強專業人才隊伍建設。生物分析是一門專業技術性較強的獨立學科，其方法和思維方式等均不同于理化分析領域[28]。以往由于大多數院校的中藥分析專業在課程設置上缺少分子生物學理論和技術的實踐課程，在校時未能系統學習相關專業知識，因此目前大多數中藥分析從業人員對于該領域是比較陌生的。一般涉及該技術的檢驗或標準研究工作并不是中藥科室在承擔，而是對這一技術更為熟悉的中藥以外的其他科室，如從事微生物或生物制品檢驗的部門科室；但是這些部門的工作人員對于中藥本身并不熟悉，導致在檢驗或標準研究中勢必會帶來一些偏差[29]。因此，應對中藥檢驗人員加強分子生物學技術的培訓，并從事相關的工作。同時，中藥檢驗部門應引入分子生物學相關專業的專門人才，才能真正將該技術涉及的檢驗和標準研究工作做好。

從長遠來看，中醫藥的良好發展離不開生物技術的參與，后者源于西方醫學的基礎研究，也可以并且應該引入到中醫藥的研究中來。在未來，生物技術的參與程度會越來越多的影響到對于中醫藥的研究深度，包括中藥質量控制的研究。因此，在中醫藥專業學生的課程設置上，應將分子生物學作為一門基礎課程，進行系統、全面、深入的學習，讓PCR技術成為中醫藥專業學生人人都會的基本技能，讓生物技術分析的理念深入人心。唯有如此，才能從根本上優化中藥檢驗人才的知識結構，適應時代發展的需要，從而推動中藥質量控制水平邁向新臺階。