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嘉峪檢測網 2020-01-16 09:44
作者：葛雨琦，葉曉霞，樂健，楊永健，王彥
復旦大學藥學院
上海市食品藥品檢驗所
國家藥品監督管理局化學藥品制劑質量分析重點實驗室
摘要
基因毒性雜質能夠損傷DNA，造成DNA 突變，致癌，嚴重危害人類健康。
本文主要針對基因毒性雜質中的N-亞硝胺類化合物，介紹其毒理學研究進展以及食品、水體、煙草、藥品等不同基質中檢測方法的研究進展，包括毒理學作用機制、前處理方法、定量方法等，旨在為藥品基質中N-亞硝胺類化合物的檢測研究提供參考。
關鍵詞：N-亞硝胺；基因毒性雜質；毒理學；檢測方法
N-亞硝胺是一類以亞硝基—NO 的氮原子與氨基中的氮原子連接，并在氨基上發生取代而生成的一類化合物，在堿性溶液中穩定。
其生成機制多樣，包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用[1]，叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應[2]，溶劑N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的氧化[3]，橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用[4]等。
基因毒性雜質是指能夠直接或間接損傷細胞DNA，產生致突變和致癌變的化合物，含有基因毒性雜質警示結構，毒性未經證明的化合物稱為潛在基因毒性雜質。
目前普遍認為基因毒性雜質損傷DNA 的機制為造成染色體斷裂，DNA 重組，在DNA 復制過程中以共價鍵結合或插入。
鑒于基因毒性雜質對人類健康的危害，歐盟發布了1 個超級化合物結構，包含了目前所有的基因毒性雜質警示基團，例如磺酸酯類、鹵代烷烴類、肼類和N-亞硝胺類等。
最近多個廠家生產的纈沙坦原料藥中檢出N-亞硝基二甲胺(NDMA)，引發制藥行業對N-亞硝胺類化合物的廣泛關注，本文主要對N-亞硝胺類化合物的毒性和檢測方法的研究進展做一綜述。
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N-亞硝胺類化合物的毒性研究
多個細胞和動物水平的實驗證明，N-亞硝胺類化合物具有強致癌作用和明顯的肝毒性，不但長期小劑量接觸可以致癌，而且一次較大劑量的沖擊也可以引發癌癥，醫學實驗中也常使用N-亞硝胺類化合物對動物進行疾病造模[5-6]。
2017 年世界衛生組織發布的致癌物清單中，多種N-亞硝胺類化合物位列一類、二類致癌物，包括常見的4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N-亞硝基降煙堿、N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基甲基乙基胺、N-亞硝基二丙胺、N-亞硝基二丁胺、N-亞硝基嗎啉、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基吡咯等。
FDA根據The Carcinogenic Potency Database(CPDB 數據庫)中的毒理學數據，通過換算，列出了可供參考的N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基二乙胺的人體攝入限值，分別為0.096 μg·d-1和0.0265 μg·d-1。
但是大多數N-亞硝胺類化合物的毒性研究仍缺乏充分的人體實驗數據，所以在進行毒理學研究時常使用階段性毒理學閾值，按照長期接觸計算，每日允許攝入限值為1.5 μg。
此類化合物常出現在腌制類食品[7]、化妝品[8]、煙草[9]、水[10]、藥品[11-13]等物質中，對人體健康具有極大的危害。
1.1 致癌機理
自20 世紀N-亞硝胺類化合物被發現以來[14]，關于此類化合物的毒性研究從未停止。
百年來陸續發現N-亞硝胺類化合物與多種癌癥的發病相關，并對其作用機制進行了進一步研究。
Gankhuyag 等[15]發現煙草中的N-亞硝胺類化合物與乳腺癌發病有因果關系，煙堿型乙酰膽堿受體(nicotine acetylcholine receptor, nAChR)是陽離子選擇性通道受體，其激活與細胞增殖、抗凋亡和血管生成過程有關，而nAChR 受體家族成員中α9nAChR 的表達在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中上調，與雌激素受體聯合刺激乳腺癌的發生。
且側流煙霧的毒性約是主流煙霧的4 倍，被動暴露也是不可忽視的高危因素。Hirata 等[16]采用醛脫氫酶(ALDH)免疫組化技術檢測4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮對腺癌人類肺泡基底上皮細胞(A549 細胞)的影響，發現煙草中特有的4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，通過劑量依賴的方式增加醛脫氫酶陽性細胞的比例，誘導活性氧產生，而產生的活性氧激活了A549 細胞中的Wnt 信號通路，進一步誘發了肺癌。
而Kume等[17]發現大鼠膀胱癌中，N-丁基-N-(4-羥基丁基)亞硝胺誘導L 型氨基酸轉運體1(L-typeamino acid transporter 1, LAT1)高表達，有利于腫瘤血管的生成，加速腫瘤的生成和轉移。
1.2 DNA 損傷機理
對N-亞硝胺類化合物與DNA 作用的進一步研究還發現，4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮經代謝活化后，會產生許多DNA 加合物，包括O2-甲基胸苷(O2-Me-dT)和O2-[4-(3-吡啶基)-4-氧代丁基-1-胸苷(O2-POB-dT)，體積較大的O2-POB-dT 具有較高的遺傳毒性，有26%的跨損傷合成發生，而O2-Me-dT 的遺傳毒性較小，但有55%的跨損傷合成發生。
2 種病變均引起細菌優勢突變T→G 的頻率增高[18]。
同時Du 等[19]對N-亞硝胺引發的DNA 加合物進行研究也發現在雙鏈質粒中，O2-POB-dT 和O4-POB-dT 加合物能中度阻斷DNA 復制，分別誘導T→A(14.9%)和T→C(35.2%)突變；另一方面，O6-POB-dG對DNA 復制有輕微抑制作用，主要引起G→A 轉變(75%)。
1.3 其他毒性機理
亞硝胺類化合物除了能夠致癌，造成DNA 突變，在其他方面也具有不同程度的毒性。
例如，N-亞硝基丁胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二苯胺等能增加大鼠體內肌酸激酶和乳酸脫氫酶活性，增加自由基水平，降低抗氧化酶活性，從而增加心血管疾病的發生率[20]。
N-Sheweita 等[21]研究了環境中常見的4 種N-亞硝胺：N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基甲基乙基胺和N-亞硝基二苯胺，通過測定雄性家兔體內17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)活性和組織病理學觀察，發現4 種N-亞硝胺均能抑制家兔肝臟和睪丸組織抗氧化酶活性，改變肝臟和睪丸組織結構，導致肝毒性和不孕癥。
O-由此可見，N-亞硝胺類化合物對健康的危害不容忽視，對各個來源的N-亞硝胺類化合物進行檢測十分必要。
2
N-亞硝胺類化合物檢測方法研究進展
目前 N-亞硝胺類化合物的檢測方法既有傳統的基于重氮化-顯色反應的鹽酸萘乙二胺法[22]，依賴于新型氧化氮/臭氧化學發光-氣相色譜檢測器的熱能檢測法[23]、氣相色譜串聯質譜法[27]、液相色譜串聯質譜法[29]，也有基于新型檢測原理的熒光檢測法[24]。
傳統的鹽酸萘乙二胺法和薄層色譜法操作簡便，對設備要求低，但靈敏度低，現在已經難以滿足分析的需要，因此靈敏度更高的新型儀器逐漸取代了傳統的分析手段。
同時分析工作者們針對不同基質中N-亞硝胺類化合物的檢測方法進行研究，開發出了不同的前處理方法，進一步提高了檢測靈敏度。
下面介紹不同基質中N-亞硝胺類化合物檢測的最新研究進展。
2.1 食品中的檢測
食品中的N-亞硝胺類化合物來源主要是各類包裝材料生產過程中副產物和腌制發酵過程的副產物。
由于食品直接與人體接觸，潛在風險高，近些年陸續開發了多種N-亞硝胺類化合物測定方法。
Lu 等[25]通過2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl)對目標化合物進行熒光標記，采用三氯甲烷-乙腈分散液液微萃取來富集標記后的目標化合物，以高效液相色譜法對泡菜、臘腸、咸鴨蛋等中式傳統腌制食品進行檢測，各種化合物定量限介于0.03~0.21 ng·g-1之間，日內精密度和日間精密度均符合要求。
該方法與熱能檢測法相比，靈敏度提高近100 倍，而且所需試劑量小，檢測儀器簡單，易推廣。
Kühne 等[26]則采用不同的溶劑對食品包裝材料進行模擬遷移實驗，包括去離子水、3%乙酸、10%乙醇和50%乙醇，利用液相色譜串聯三重四極桿質譜對遷移樣品中的N-亞硝胺類化合物進行檢測，前處理方法簡便，依靠質譜進行定量檢測，靈敏度高。
同時，Kühne等在實驗中也發現環境溫度為40 ℃時，N-亞硝基二苯胺在純水、3%醋酸、10%乙醇、50%乙醇4 種介質中均易發生降解，6 h 內含量下降明顯，這提示在后續的研究過程中要注意低溫保存N-亞硝基二苯胺。
Seo 等[27]采用液液萃取結合固相萃取的方式，以Extrelut NT 為液液萃取基質，Sep-PakFlorisil 為固相萃取填料，以氣相色譜串聯三重四極桿質譜(化學電離源)定量，對食品中的無脂類基質和富脂類基質中的N-亞硝胺類化合物進行檢測，線性、精密度、回收率較好，7種化合物定量下限范圍為0.3~0.58 μg·kg-1；此研究首次針對不同基質的特點開發不同前處理方法，可以實現多種同類型基質樣品的同時檢測，在色譜柱的選擇上也采用了DB-5ms柱串接DB-WAX 柱，能夠更好地對化合物進行分離，方法具有通用性，應用前景良好。
Zhao 等[24]創新性地采用了柱前熒光標記法檢測N-亞硝胺類化合物。樣品用二氯甲烷提取甲醇復溶后，N-亞硝胺化合物進行脫氨反應，然后用1,2-苯并-3,4-二氫咔唑-9-氯甲酸乙酯(BCEOC)對目標N-亞硝胺化合物進行標記，再利用BCEOC 化合物中的大型共軛結構，通過液相色譜-質譜聯用儀進行檢測，N-亞硝基吡咯、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基二丙胺、N-亞硝基二丁胺4 種化合物線性相關系數大于0.999 8，檢測下限在1.3~2.5 ng·L-1之間，精密度RSD 小于7%。
對食品樣本牛肉、咸鴨蛋、腌黃瓜等進行加樣回收試驗，回收率均達到90%~105%。該方法利用N-亞硝胺結構上的叔胺N 進行檢測，改變了常見的檢測模式，為新型檢測方法的開發提供了思路。
2.2 水體中的檢測
含氯消毒劑的使用和臭氧化消毒是水體中N-亞硝胺的產生途徑之一[28]。
由于水體在生活中無處不在，但污染經常被忽視或難以察覺，因此有必要對環境水和飲用水中的N-亞硝胺類化合物含量進行檢測。
Zhao 等[29]用自制的固相萃取小柱對飲用水中的N-亞硝胺類化合物進行提取分離，弱堿性條件下上樣，二氯甲烷洗脫，液相色譜串聯三重四極桿質譜定量檢測，并對比了電噴霧和大氣壓電離2 種離子源對N-亞硝胺的離子化效果，2 種電離方式均能檢測到目標N-亞硝胺的電離。
電噴霧離子源(ESI)能產生母體化合物的特征離子和所有N-亞硝胺的子離子，大氣壓化學電離離子源(APCI)則不能產生熱不穩定的N-亞硝胺如N-亞硝基二苯胺的母離子，而母離子和子離子的檢測對于水中痕量N-亞硝胺的專屬性測定具有重要意義。
因此，對熱不穩定的N-亞硝胺化合物而言，ESI 有利于提高離子化效率，提高靈敏度。
McDonald 等[30]則采用椰子活性炭為填料的固相萃取小柱，對水中N-亞硝胺化合物進行富集，二氯甲烷洗脫后以氣相色譜串聯三重四極桿質譜檢測，并加入同位素內標對檢測結果進行校正。
城市自來水和3 次處理城市廢水檢測的日內RSD 和日間RSD 均小于10%，檢測下限低于1 ng·L-1。
Chen 等[31]用椰子殼活性炭小柱富集水中的亞硝胺，無水硫酸鈉脫水，氮吹至500 μL 后進樣，比較了EI 源的單極質譜和串聯質譜定量測定結果，發現串聯質譜在去除基質干擾方面具有更好的優勢。
Fan 等[32]開發了一種固相微萃取前處理結合氣相色譜-質譜聯用儀對飲用水和啤酒中的7 種N - 亞硝胺類物質進行檢測的方法， 以碳分子篩和聚二甲基硅氧烷( c a r b o x e npolydimethylsiloxane)為固相萃取纖維，樣品在85 ℃保持60 min 條件下完成吸附后，轉移至氣相色譜進樣口，250 ℃保持5 min 解吸附，以選擇離子模式定量檢測，飲用水中定量下限可達0.6~2 ng·L-1，啤酒中定量下限可達20~52.4 ng·L-1，2 種樣品中回收率為84.5%~95.5%；這種前處理方法所需溶劑少， 而且最大限度降低了基質效應的影響。
近年來隨著分子印跡技術的發展，分子印跡結合固相萃取技術也在N-亞硝胺類化合物的檢測中得到應用。
Li 等[33]采用沉淀聚合法，以甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，N,N-二苯基甲酰胺為模板分子，合成了一款分子印跡固相萃取小柱用于水中N-亞硝基二苯胺 (NDPhA)的富集分離，超純水中的NDPhA 的加樣平均回收率均高于94%，檢測下限和定量下限分別為0.8 ng·L-1和2.4 ng·L-1，實際樣品中的NDPhA 的加樣回收率在92%~107%之間，RSD 在0.3%~7.9%之間。
Li 等還考察了方法的耐用性，結果表明該萃取小柱在pH 5~10 和鈣、鐵、鎂、鉀、錳、銅、鋅多種離子存在的條件下均可以達到90%以上的回收率。綜上可見，水中N-亞硝胺類化合物的檢測方法越來越重視樣品的前處理，期望以更少的試劑消耗，最大限度地降低基質干擾。
2.3 煙草中的檢測
煙草中的N-亞硝胺類化合物是在煙草調制、加工過程中，由煙草中的生物堿發生亞硝化反應生成的，是煙草中特有的化合物，常見的有4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基降煙堿(NNN)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)4種。
Zhang等[34]采用了分散固相萃取的方式對煙草中的N-亞硝胺進行提取，分散固相萃取(DSPE)是一種快速、耐用、簡便、廉價、安全的前處理方法，向煙氣提取物中加入0.1%三甲胺水溶液并超聲處理30 min后，取1.5 mL溶液加載至DSPE小柱上，依靠渦旋和離心進行提取分離，無需復雜的樣品處理步驟。
采用高效液相色譜結合軌道離子肼質譜儀進行檢測，通過對6個平行樣品的分析，驗證了該方法的有效性，平均回收率為84.7%~118%，RSD小于15%。
Chen等[35]采用二維液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀，對弗吉尼亞型卷煙煙氣中特有的中低濃度的N-亞硝胺類化合物進行了分析。
先用Cambridge纖維收集主流煙霧，并用0.1mol·L-1乙酸銨溶液萃取，然后超聲30 min，用0.22 μm聚四氟乙烯濾頭過濾，作為供試品溶液。
供試品溶液進樣后首先采用強陽離子交換柱對煙氣中酸性和中性組分進行第一維分離，然后采用反相液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀，并以同位素氘代物為內標，在多反應監測模式下，對卷煙主流煙氣中的N-亞硝胺類化合物進行了高靈敏的測定；
與傳統方法相比，該方法幾乎沒有基質干擾，測得的亞硝胺含量在0.027~0.094 ng·mL-1范圍內，重現性好，準確度高；最后，將該方法應用于肯塔基州香煙的分析，結果與煙草科學研究合作中心聯合試驗的結果一致。
Zhang等[36]自主設計了一種前處理方式，首先利用Cambridge濾板和聚四氟乙烯注射器過濾樣品，然后采用自主設計的全自動在線固相萃取技術對樣品進行前處理，液相色譜-串聯質譜法定量，對NNN、NNK、NAT和NAB的定量下限分別達到每根香煙6.0、1.0、3.0和0.6 pg的水平，遠低于目前市售香煙中的最低水平，方法的準確度在92.8%~107.3%之間，日內和日間的RSD分別小于5.4%和7.5%。
該方法具有靈敏度高，選擇性好，準確度高，自動化程度高，能夠批量處理等優點。
2.4 藥品中的檢測
藥品中的N-亞硝胺類化合物的研究在20世紀70年代就已經開展[11-13]，但是后續的研究進展緩慢，只有有少量的文獻報道。
Castegnaro等[37]對水蒸氣蒸餾進行了改進，在蒸餾體系中加入一定量的礦物油，以克服蒸餾過程中的起泡現象，并將此方法應用于氨基比林、土霉素、雙硫侖中N-二甲基亞硝胺的檢測。
該方法以氣相色譜進行分離，以熱能檢測器進行定量，最低檢測限可低至1 μg·kg-1，但該方法取樣量大，且操作過程煩瑣，提取效率較低。
Norwood等[38]采用氣相色譜-熱能檢測器定量分析吸入氣霧劑中揮發性N-亞硝胺。該方法從藥品包裝中提取目標分析物，并通過氣相色譜-熱能分析檢測進行分析。
樣品分析表明，在每罐1 ng的微量水平上，吸入氣霧劑未檢測出N-亞硝胺。
2018年7月纈沙坦原料藥中檢測出N-亞硝基二甲胺(NDMA)以及厄貝沙坦制劑中檢測出N-亞硝基二乙胺(NDEA)，氯沙坦鉀制劑中檢測出N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)為我們敲響了警鐘，開發高靈敏度的檢測方法和簡便高效的前處理方法迫在眉睫。
因此各國藥品監管部門紛紛發布檢測方法，要求加強對N-亞硝胺類化合物的監測，表1中列出中國、美國、歐盟藥監部門推薦的檢測方法，并對前處理方法、定量方法、靈敏度水平進行了總結。
這些檢測方法僅是針對NDMA或NDEA進行檢測，N-亞硝基二丙胺等其他N-亞硝胺類化合物的檢測，還需要進一步開發更適合的方法。
中國食品藥品檢定研究院[39]的方法采用甲醇溶解樣品后直接進樣，但纈沙坦易溶于甲醇，大量不揮發性物質進入質譜系統，易污染離子源，造成背景噪音升高。
FDA直接進樣的方法則采用二氯甲烷作為提取溶劑，除溶解大量基質外，二氯甲烷的強揮發性對準確定量也有一定的影響。
雖然相對食品、煙草，藥品中的基質較為簡單，但大量基質進入檢測系統，多次進樣后系統的穩定性、靈敏度均會受到影響。
因此如何進行前處理，去除基質干擾，是今后藥品中N-亞硝胺檢測今后研究的重點。
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總結與展望
食品、水體、煙草中的N-亞硝胺類化合物的檢測已經開展了多年，而關于藥品中N-亞硝胺類化合物的研究則進展緩慢。
自纈沙坦中檢出N-亞硝基二甲胺后，N-亞硝胺類化合物的檢出范圍不斷擴大，今后制藥企業、藥品監管部門對此類化合物的毒性研究和檢測方法研究勢必更加重視，但是沙坦類化合物中N-亞硝胺類物質的檢測仍然存在一些難點。
首先，沙坦類化合物與N-亞硝胺類雜質極性相近，且N-亞硝胺類雜質的含量相對于沙坦類藥物來說屬于痕量雜質，藥品中大量基質的存在影響方法的穩定性和準確度。
所以如何在前處理過程中除去大量的沙坦類藥物，而不損失或盡可能少損失N-亞硝胺類化合物是前處理過程中需要關注的重點。
雖然目前在食品、水、煙草領域，有很多新穎的前處理方法，如椰子殼活性炭固相萃取小柱萃取法[30]、熒光標記衍生化結合分散液液微萃取法[25]、分子印跡固相萃取小柱萃取法[33]，但是受化合物極性、取樣量等限制，這些處理方法無法在藥品體系中直接應用。
因此原理簡單，操作簡便，回收率穩定的前處理方法更適合于藥品體系。
其次N-亞硝胺類化合物是一系列含有相同官能團的化合物，因此如何保證檢測的專屬性則是定量環節需要優先考慮的。
相比于單四極桿質譜儀，選擇性更強的三重四極桿質譜儀能夠提供更好的專屬性，避免假陽性的結果。
在此，由衷地期望本文為藥品中N-亞硝胺類基因毒性雜質檢測提供參考，能有更深入的研究成果出現，能夠擴大檢測范圍，提高分析效率，提高檢測靈敏度，嚴格保證藥品質量安全。
來源：藥物分析
