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嘉峪檢測網 2025-04-24 20:47
摘 要：利用液相色譜-質譜法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮（AOZ），并對測定結果的不確定度進行評定，分析影響測定結果準確性的因素，從而提高檢測結果準確性。按照GB 31656.13—2021《食品安全國家標準 水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》測定淡水鱸魚中的AOZ，建立數學模型，對影響測定結果的不確定度來源如標準物質純度、溶液配制、樣品稱量、樣品溶液制備、標準曲線擬合、測量復性等因素進行分析和評定。液相色譜-質譜法測定淡水鱸魚中AOZ的結果為（10.09±1.10） μg/kg，k=2。標準物質純度、溶液配制、標準曲線擬合以及樣品測量重復性是測量不確定度的主要來源，在檢測過程中應加以控制。
關鍵詞：液相色譜-質譜法；淡水鱸魚；3-氨基-2-唑酮；呋喃唑酮代謝物；不確定度
呋喃唑酮濫用導致其在淡水鱸魚魚體中殘留，威脅人體健康[1?2]。建立準確檢測方法評估淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)含量至關重要。液相色譜-質譜(LC-MS)法作為一種高效、靈敏的分析技術，在危害物殘留檢測領域得到了廣泛應用[3]。該技術以其良好的分離性能、快速的檢測速度和高敏感度著稱，在檢測復合材料中微量藥物殘留方面表現出優越的適應性[4]。在實際應用中，由于各種因素的影響，LC-MS法的測量結果會存在一定的不確定度[5]，因此，對LC-MS法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ的不確定度進行評定具有重要意義[6?7]。不確定度評定是實驗室檢測的關鍵，反映測量結果的可靠性與準確性[8]，可以幫助檢測人員分析誤差來源，從而減少誤差，提高測量結果的準確度[9?11]。同時，它也是實驗室間數據比對和認可的重要依據。
目前國內尚無測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ的標準方法，為了提高測定結果的準確度，確保相關產品的質量安全，筆者采用LC-MS法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ，分析了標準物質純度、樣品稱量、溶液配制、樣品溶液制備、標準曲線擬合以及樣品測量復性等因素對測定結果的影響，全面評定其不確定度[12?14]。結合文獻和試驗數據，驗證了評定結果的準確性和可靠性[15?16]。該方法可以為食品安全監管部門提供科學依據，為淡水鱸魚養殖業的健康發展提供技術支撐[17?19]。同時，也可為其他危害物殘留測定結果的不確定度評定提供參考和借鑒[20]。
1.實驗部分
1.1主要儀器與試劑
液相色譜-串聯質譜儀：QTRAP 4500型，美國應用生物系統公司。
數字顯示天秤：XS205DU型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司
離心機： A-14c型，德國賽多利斯儀器公司。
多管渦旋混勻儀：Multi Reax型，德國海道爾夫公司。
平行濃縮儀：M64型，北京萊伯泰科公司。
超聲波清洗器：XM-5200UVF型，昆山市超聲儀器公司。
甲醇、乙腈：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。
鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
2-硝基苯甲醛：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。
磷酸氫二鉀、乙酸乙酯：均為優級純，國藥集團化學試劑有限公司。
AOZ標準溶液：100 mg/L，Urel=5.0% (k=2)，批號為2202778，上海安譜科學儀器公司。
AOZ-D4標準溶液：99.6 mg/L，Urel=5.0% (k=2)，批號為S111929，天津阿爾塔科技有限公司。
實驗用水為GB/T 6682—2008規定的超純水。
1.2儀器工作條件
1.2.1液相色譜儀
色譜柱：AtiantisTMT3色譜柱[150 mm×2.1 mm，3 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇-0.1%甲酸溶液；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～1 min時B相體積分數為10%，1～4 min時B相體積分數由10%增加至95%，4～5.5 min時B相體積分數為95%，5.5～6 min時B相體積分數由95%降至10%，6～8 min時B相體積分數保持為10%；流動相流量：0.35 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL。
1.2.2質譜條件
監測模式：ESI正離子多反應監測(MRM)模式；電噴霧電壓：5 500 V；助燃氣和噴霧壓力：0.448 2 MPa；氣體簾幕壓力：0.206 9 MPa；輔助加熱氣溫度：550 ℃。AOZ及內標質譜參數見表1。
表1AOZ及內標物質譜參數
Tab. 1Mass spectrometry parameters of AOZ and internal standard
注：帶*號的為定量離子。
1.3溶液的配制
內標溶液： 0.1 μg/mL，準確量取AOZ-D4標準溶液1.0 mL，置于10 mL A級容量瓶中，以甲醇定容至標線，配制成AOZ-D4的質量濃度為9.96 μg/mL的儲備液。再取此儲備液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標線，混勻。
AOZ標準儲備液： 0.1 μg/mL，精密量取AOZ標準溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標線，得到AOZ的質量濃度為10 μg/mL的標準中間液。移取0.1 mL標準中間液至10 mL的容量瓶，用甲醇定容至標線，混勻。
AOZ系列標準工作溶液：移取AOZ標準儲備液0.1、0.2、0.5、1、2、3 mL，分別置于6只10 mL棕色容量瓶中，均精確加入50 μL內標溶液，用甲醇稀釋后定容至標線，得到AOZ的質量濃度分別為1、2、5、10、20、30 ng/mL的系列標準工作溶液。
1.4樣品處理
稱取適量經檢驗為陽性的淡水鱸魚樣品，用粉碎機粉碎制成肉糜，冷凍密封保存于玻璃容器中。將冷凍的陽性樣品于室溫下解凍，精密稱取2.0 g (精確至0.1 mg)，置于離心管中，精確加入50 μL內標溶液，用旋渦混合器混合1 min。隨后加入0.5 mol/L鹽酸溶液5 mL和0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15 mL，再次旋渦混合1 min。將試管置于恒溫振蕩儀中，在37 ℃的條件下，避光振蕩16 h。
取出離心管，冷卻至室溫，用0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液調pH值至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，以6 000 r/min轉速離心5 min，取上清液至10 mL玻璃離心管中，在40 ℃下氮氣吹干。加入5% (體積分數，下同)甲醇溶液1.0 mL溶解殘留物，將溶液轉移至1.5 mL離心管中，以14 000 r/min轉速離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，濾液即為樣品溶液。
1.5測定方法
按照1.2儀器工作條件，分別測定AOZ系列標準工作溶液和樣品溶液，以AOZ質量濃度為橫坐標，以特征離子色譜峰面積和內標色譜峰面積比值為縱坐標，繪制標準工作曲線，根據標準工作曲線計算樣品中AOZ的含量。
2.結果與討論
2.1數學模型的建立
根據測量原理，建立數學模型如式(1)和式(2)所示。
(1)
(2)
式中：A1——樣品溶液中AOZ的色譜峰面積；
A2——內標物的色譜峰面積；
B0——標準工作曲線的截距；
B1——標準工作曲線的斜率，mL/ng；
w——樣品溶液中AOZ的質量分數，μg/kg；
V——樣品溶液稀釋總體積，mL；
ρ——樣品溶液中AOZ的質量濃度，ng/mL；
m——稱取樣品的質量，g；
1 000——換算系數。
2.2不確定度來源
由測定過程和數學模型可知， LC-MS法測定淡水鱸魚中AOZ的不確定度來源主要包括以下6個方面：
(1) 標準物質的相對標準不確定度urel(ρ)；
(2) 溶液配制引入相對標準的不確定度urel(S)；
(3) 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)；
(4) 樣品溶液制備引入的相對標準不確定性urel(X)；
(5) 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(L)；
(6) 測量重復性引入的相對標準不確定度urel(R)。
2.3不確定度評定
2.3.1標準物質的相對標準不確定度urel(ρ)
根據標準物質證書，AOZ標準溶液的相對擴展不確定度為5%，k=2，則標準物質的相對標準不確定度：
2.3.2溶液配制引入的相對標準不確定度urel(S)
配制溶液時，用8只10 mL的A級容量瓶，使用0.1 mL移液管2次，使用0.2 mL移液管1次，使用1 mL移液管3次，使用5 mL移液管2次。在整個試驗過程中，內標溶液的加入量不影響所配制的溶液濃度，所以配制內標溶液時產生的不確定性不予考慮。容量瓶和移液器體積定值準確性引入的不確定度和定容溶劑因溫差(校準溫度為20 ℃，實驗室溫度為25 ℃)產生的體積膨脹引入的不確定度均服從均勻分布，包含因子k=
； 5%甲醇溶液中水含量比較高，故其膨脹系數以水計，水的體積膨脹系數為0.001 18 mL/℃。由使用的器皿因定值引入的不確定度及定容溶劑因溫差產生的體積膨脹引入的不確定度見表2。
表2溶液配制引入的不確定度
Tab. 2Uncertainty introduced in solution preparation
2.3.3樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)
連續取樣2 g樣品共10次，所得平均質量
為2.003 g。
采用精度為1 mg的XS205DU型電子天平稱量，其檢定的最小分度值e等于10倍的觀測精度，即10 mg。在試驗所涉及的稱量范圍內，該電子天平顯示的最大容許誤差限定為其檢定分度值的一半，即0.5倍的e值，計算結果為5 mg，即0.005 g。此誤差在統計上呈均勻分布，k=，因此天平稱量引入的標準不確定度：
g
樣品稱量引入的相對標準不確定度：
urel(m)＝
/＝0.004 56
2.3.4樣品溶液制備引入的相對標準不確定度urel(X)
樣品溶液制備過程中，使用1 mL移液管移取5%甲醇溶液1.0 mL溶解殘留物。由表2可知，1 mL移液管移取1.0 mL 5%甲醇溶液引入的相對標準不確定度：
urel(X)==
=0.006 73
2.3.5標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(L)
在1.2儀器工作條件下，測定AOZ系列標準工作溶液，結果見表3。以色譜峰面積和質量濃度進行最小二乘法擬合，得到線性方程為y=0.233 01x+0.072 17，相關系數為0.997。殘差標準偏差sR按照貝塞爾公式(3)計算，標準曲線擬合引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別按式(4)和式(5)計算。
表3系列標準工作溶液測定結果
Tab. 3Determination results of series standard working solution
(3)
(4)
(5)
式中：sR——標準曲線的殘差標準偏差；
n2——系列標準工作溶液的測量次數，n2=6；
Yj——AOZ與內標的色譜峰面積比值；
Aj——第j次測定的AOZ色譜峰面積；
Aj1——第j次測定的內標色譜峰面積；
B0——標準曲線截距；
B1——標準曲線斜率；
j——第j次測量的標準溶液的質量濃度，ng/mL；
n1——樣品溶液的測量次數，n1=10；
——樣品溶液質量濃度平均值，ng/mL；
——系列標準溶液質量濃度平均值，ng/mL；
u(L)——標準曲線擬合引入的標準不確定度；
urel(L)——標準曲線擬合引入的相對標準不確定度。
將表3數據代入式(4)，計算標準曲線擬合引入的標準不確定度：
=0.582 8 ng/mL
標準曲線擬合引入的相對標準不確定度：
=0.028 8
2.3.6測量重復性引入的相對標準不確定度urel(R)
對樣品溶液平行測定10次，測定結果表4。
表4樣品溶液質量分數測定結果
Tab. 4Determination results of mass fraction of sample solution
測量重復性引入的標準不確定度：
u(R)=
=0.281 7 μg/kg
測量重復性引入的相對標準不確定度：
urel(R)=
=0.027 9
2.4合成相對標準不確定度和結果表示
各相對標準不確定度分量評定結果見表5。
表5不確定度分量匯總
Tab. 5Summary of uncertainty components
上述各不確定度分量彼此獨立不相關，則合成相對標準不確定度：
rel(w)
= 0.055
合成標準不確定度：
u(w)=
×urel(w)=0.55 μg/kg
2.5擴展不確定度及結果表示
取置信水平為95%，擴展因子k=2，則擴展不確定度：
U=k×u(w)=1.10 μg/kg
LC-MS法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮代謝物AOZ的結果可表示為(10.09±1.10) μg/kg，k=2。
3.結語
液相色譜-質譜法測定淡水鱸魚中呋喃唑酮酮代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)含量的測量不確定度主要來源于標準物質純度、溶液配制、標準曲線擬合以及樣品測量重復性。在實驗過程中通過選用高純度標準物質，規范并使用高精度的移液器、容量瓶以及天平，提升實驗人員的操作水平，增加平行試驗的次數，可降低不確定，提高檢測結果的可靠性。
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引用本文：黃海霞，廖子祎，王海波，等 . 液相色譜-質譜法測定淡水鱸魚中3-氨基-2-唑酮的不確定度評定［J］. 化學分析計量，2025，34（1）： 129.(HUANG Haixia, LIAO Ziyi, WANG Haibo, et al. Evaluation of uncertainty for determination of 3-amino-2-oxazolone in freshwater perch by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 129.)
來源：化學分析計量
