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嘉峪檢測網 2025-04-27 17:53
背景
蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學 George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 Analytical Biochemistry 中首次被稱為 Western Blot。最開始做印跡的是一個叫 Southern 的科學家，但印跡的對象是 DNA 鏈，他把這種技術稱為 Southern blot，后來出現了兩個過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個針對RNA，一個對蛋白質，人們分別把這兩種技術的稱為 Northern 和 Western，與這兩個技術的發明人沒有關系了。
一：蛋白質的樣品制備
由于這一步方法各異，具體步驟請參考試劑盒的說明書即可。蛋白質的樣品制備是 Western Blotting 的第一步，樣品制備是關鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題：
在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重復性。
選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。
防止蛋白質在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。
樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20 ul 檢測蛋白質定量用），然后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 中長期保存，但要注意不要反復凍融，因為會使蛋白的抗原特性發生改變。
若蛋白提取過程存在問題或蛋白發生降解則很難進行好之后的實驗，也就很難做出好的結果了。除此之外 loading buffer 的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時也應注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。
二：蛋白質定量
如果要定量的話，一般選擇 BCA 或者 Bradford 方法，BCA 要求檢測波長為 562 nm，Bradford 為 595 nm。具體方法見各試劑盒說明書。為避免假陽性結果，建議先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考馬 G250 混合看是否產生顏色。測完蛋白含量后，計算含 50～100 ug 蛋白的溶液體積即為上樣量（一般 8 cm 寬的迷你膠每個泳道最大能承載的蛋白質量為 150 ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過大）。
網上有人喜歡等質量上樣（即每個泳道的上樣體積不一但質量一定），也有使用等體積上樣（即先把各個樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質量上樣，計算上樣體積時需包含 loading buffer 的體積）。按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。
上樣總體積一般不超過 15 ul，加樣孔的最大限度可加 20 ul 樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內，將燒杯置于石棉網上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮 3～5 min 使蛋白充分變性。也可以使用 PCR 儀 95° 加熱 5 min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在 4 ℃ 冰箱短時間保存，也可在 -20℃ 冰箱保存數月，但是反復凍融會使蛋白質的抗原特性改變。
三：SDS-PAGE 電泳
1. 清洗玻璃板
蘸點洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。
2. 灌膠與上樣
① 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。
② 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入 TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時要充分混勻，此外應保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。
灌膠時掌握好速度，避免氣泡產生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。
未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性，操作時應該戴手套防護。梳子插入濃縮膠時，應確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長度為插入的梳齒長再加 1 cm）。
③ 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時間由 AP 以及 TEMED 決定，通常在 30 min 左右，AP 不新鮮會導致聚合變慢，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不會超過 1 h，若超過 1 h 甚至更長仍未聚合，應檢查配制的操作有無錯誤。
由于 TEMED 催化 APS 釋放相關化學基團，再由 APS 釋放的基團催化 Acr/Bis 聚合，所以如果 APS 不新鮮的話加再多的 TEMED 效果也不佳，這就是為什么推薦 APS 每周新鮮配置的原因。
④ 按說明書配積層膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。
由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
⑤ 趁積層膠聚合的這段時間，取適當體積樣本混合 1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95～100° 加熱 5 min，若有沉淀可用稍低溫度，比如 45~55° 加熱 1 h 達到變性的目的。我一般習慣分裝 20 ul 到 PCR 管里，先和 loading buffer 混合好，臨用前用 PCR 儀加熱 95 °C 5 min，效果不錯。
⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準備上樣（我們使用的是大連競邁科技公司的 MV-III 型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過內測的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用 5 ml 注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。
目前我們做的 mini 膠上有 10 個上樣孔，一般在第一個孔加入 marker（我用的是 Fermentas 預染 marker），其余 9 個孔加入樣品，也可在頭尾孔內加入 marker，中間 8 個孔加樣品。加樣前樣品應先離心，尤其是長時間放置的樣品。在未加樣的孔中應加入等量的樣品緩沖液。上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用 10 ul 的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。
3. 電泳
電泳槽內加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網上有資料建議低電壓短時間的預電泳，清除凝膠內的雜質，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對這種做法，理由是會破壞緩沖系統 pH 的不連續性。
請各位按照實際經驗來做即可。電泳時間和電壓說法各異。按照各實驗室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。
電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。為減少蛋白質條帶的擴散，上樣后應盡快進行電泳，電泳結束后也應直接或者轉印
四：轉膜
我們實驗室使用的是半干轉膜電泳槽。對于轉印 90 kd 以下的蛋白，轉膜液都不用加 SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入 0.037 % 的 SDS。
1. 在電泳結束前 20 min 開始準備轉膜所需的東西。轉一張膜需準備 6 張的濾紙（長一般為 8.1～8.3 cm，寬度根據裁的膠大小實際測量，但膠一般會縮水，所以裁 8 cm 就行）和 1 張 PVDF 膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1 min～2 min。目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
2. 將玻璃板撬開才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取 10 ml 注射器吸滿轉印緩沖液，往玻璃板與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者自然分開。
取出凝膠后應注意分清上下，可以在右上角裁一個小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照 marker 指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉膜，前一種方法更加節約材料，但操作稍微麻煩了一點。在加有轉移液的培養皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF 膜和濾紙，平衡 10 min 左右，也是為了除去濾紙和轉移膜中的氣泡以及膠上多余的 SDS。
3. 帶上手套，平放轉移槽的底座，依次在石墨電極上疊放 3 張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF 膜（此時可在 PVDF 右上角減去一個角，以辨明轉膜后的蛋白面與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外 3 張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。
用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路，大大降低轉移效率，如果同時轉好幾條膠的時候更要小心，有一個膠短路就會影響整體的轉移效率）。最后將轉移槽的上蓋扣上，接通電源開始轉膜。
由于設備昂貴，第一次操作應向熟手請教，否則短路可能燒壞設備！轉完后立即清洗設備，特別是金屬上蓋，轉膜液特別容易在金屬上蓋上形成結痂，影響設備的正常使用，我們實驗室今年做 western 的同志因為忽略這一點，轉膜儀燒壞了好幾次。
4. 依據分子量大小電泳 15～60 min。如果初次轉膜，可以根據一般經驗，即多少 kD 的蛋白就轉多少分鐘，再根據結果調整時間。之后斷開電源，取出轉移膜進行后繼實驗。
5. 為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染。傳統方法是將膜用 1×麗春紅染液染 5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實際上更常用且簡便的方法是先將膜晾干，然后浸入 20% 的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此方法僅僅適合 PVDF 膜）。將膜晾干備用。使用預染 marker 話可以看見 marker 的顏色轉印到了膜上，但是憑借這個顏色來判斷是否轉印完全或轉印過頭是不可靠的。
五：免疫雜交反應
1. 將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h 即可。如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質。實際經驗表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。
2. 將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用 TBST 稀釋也可以，當然熟練后還可以自由發揮，配制一些自己的復方稀釋液）至適當濃度（可以在 1.5 ml EP 管中配置工作液，常用稀釋倍數為 1:200，1:500，1:1 000，具體需要預實驗進行摸索，用后可回收重復用 2～3 次，但回收重復利用的效果如何就要看抗體的質量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應在 2～3 天內使用，4 度保存，避免反復凍融。）
撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術室的病理袋，質量不錯，減去下面的折疊部分，用封口器（40～80 元一個）封上，不漏液即可）。37° 孵育 1 h 之后轉移到室溫下再孵育 1 h（或者 4°孵育過夜），用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。也可以多洗幾次，比如 4 次，每次 5 min。
3. 在培養皿內加入二抗稀釋液（10 ml 足夠了，一般 1:1 000 甚至 1:10 000 用 TBST 稀釋），放在搖床上，室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min，進行化學發光反應。選擇好一個合適的條件不要輕易改變，另外相比一抗，二抗作用的時間應嚴格控制，實踐證明一抗時間長點可能沒什么關系，而二抗時間若過長過短都將會直接影響結果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。
六：化學發光（ECL），顯影，定影
1. 現在工作臺上鋪一張保鮮膜，將 PVDF 膜放在保鮮膜上。將 ECL 的 A 和 B 兩種試劑在 EP 管內等體積混合（注意吸完 A 試劑后吸 B 試劑前要患槍頭），然后均勻滴在 PVDF 膜的蛋白面，反應 1～2 min 后，將 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干，之后轉移到在 X 片夾中預先鋪好的保鮮膜上一側，把另一側翻過來蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。
2. 在暗室中，將 1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X-光片，用切紙刀剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大 1 cm）；打開 X-光片夾，把 X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上 X-光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為 1 min 到 2 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果（也有人重疊壓好幾張片，固定曝光 5~10 分鐘，從這好幾張片中選出最合適的底片）；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。
顯影時間一般為 1~2 min（20～25 ℃），溫度過低時（低于 16 ℃）需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時間一般為 5~10 min,以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干（注意：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結果產生影響）。
X 光片一般選用柯達原裝的生物實驗專用柯達 X-OMATBT 膠片 .顯影液和定影液最好每周配置一次，避光室溫保存，顯影和定影液是最便宜的試劑了，千萬不要因為它而影響了整個結果。
七、凝膠圖象分析
將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值，比如 bio-rad 的 Quantity One。如何使用敬請關注我們下一期內容。
主要參考資料
WB 實戰指南+正確使用 Quantity One定量 by jacqueslm2001
Abcam 的 western 新手指南
土豆網的 western blot 視頻 上海交大出品
《分子克隆實驗指南》精編版 化學工業出版社
《抗體技術實驗指南》科學技術出版社
milipore 的 western blot 的優化方案
Western blot 步步看--網絡流傳最廣的資料，作者不詳
Bio-rad 蛋白印跡手冊
來源：生物學霸
