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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2021-05-29 14:05
質(zhì)譜分析法是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域和生物大分子研究領(lǐng)域中最重要的分析技術(shù)。由于我們對(duì)蛋白質(zhì)鑒定、定量和分析的要求越來越高，希望檢測(cè)技術(shù)的靈敏度也越來越高，同時(shí)能夠?qū)Ω鼮閺?fù)雜的樣品進(jìn)行分析處理，因此推動(dòng)了質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一大批新興的質(zhì)譜分析方法和儀器。本文將對(duì)近幾年質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行一個(gè)詳細(xì)的介紹。
長(zhǎng)期以來，質(zhì)譜技術(shù)只能用來分析一些耐熱的小化合物，因?yàn)槲覀儺?dāng)時(shí)還無法有效地、溫和地使樣品離子化，也無法有效地在不導(dǎo)致樣品斷裂的前提下將離子化的樣品從固態(tài)轉(zhuǎn)變成氣態(tài)。
在上世紀(jì)80年代末誕生了兩項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步，即電噴射離子化技術(shù)（electrospray ionization, ESI）和基質(zhì)輔助激光解析離子化技術(shù)（matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI）。
這兩項(xiàng)技術(shù)解決了生物大分子的離子化問題，它們的出現(xiàn)，極大地推動(dòng)了質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，我們終于可以使用質(zhì)譜技術(shù)來分析蛋白質(zhì)組成問題了。隨后又催生出了一大批新型的用于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的質(zhì)譜檢測(cè)儀，比如Q-Q-ToF質(zhì)譜儀（Hybrid quadrupole time-of-flight instrument）和ToF-ToF質(zhì)譜儀（tandem time-of-flight instrument）等（表1）。
表1 各種常見質(zhì)譜儀性能簡(jiǎn)介。表中√表示具有該功能，（√）表示可選該功能。+、++和+++分別表示可能或適度、好或很好、優(yōu)秀或非常優(yōu)秀。Seq表示連續(xù)的。
質(zhì)譜儀不僅能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)多肽的分子量和氨基酸序列，還能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)以及翻譯后修飾情況。在檢測(cè)蛋白質(zhì)多肽的分子量和氨基酸序列時(shí)，使用單級(jí)質(zhì)譜儀（single-stage mass spectrometers）就足夠了，而在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)以及翻譯后修飾情況時(shí)除了進(jìn)行單級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)之外，還會(huì)選擇特殊的離子通過碰撞對(duì)其進(jìn)行裂解分析。在這種串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry, MS/MS）檢測(cè)試驗(yàn)中，我們可以通過對(duì)蛋白質(zhì)裂解片段的分析獲取詳細(xì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。我們下面將要介紹的質(zhì)譜儀都是在蛋白質(zhì)研究中最常用到的儀器。這些質(zhì)譜儀之間在物理原理、性能指標(biāo)、操作模式以及應(yīng)用范圍方面各有差異。
飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和hybrid ToF質(zhì)譜儀
在ToF質(zhì)譜儀中，我們可以通過某個(gè)離子飛越一段長(zhǎng)度真空管道的時(shí)間推算出它的質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio）。現(xiàn)在，ToF質(zhì)譜儀的性能已經(jīng)得到了很大的提升，尤其是在分辨率和準(zhǔn)確性方面進(jìn)步最為明顯。現(xiàn)在，分辨力超過12,000已經(jīng)是質(zhì)譜儀的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)了。如果按照正確的操作規(guī)程，也可以達(dá)到百萬(wàn)分之一（ppm）級(jí)別的準(zhǔn)確率。ToF質(zhì)譜儀是進(jìn)行ESI質(zhì)譜和MALDI質(zhì)譜檢測(cè)的基礎(chǔ)平臺(tái)。
Q-Q-ToF質(zhì)譜儀在MS模式和MS/MS模式下就具有非常高的分辨率和準(zhǔn)確率。在MS模式下，四級(jí)桿（quadrupole）起到了引導(dǎo)離子飛行的作用。而在MS/MS模式下，母離子（precursor ions），即在ESI過程中產(chǎn)生的離子被“挑選”出來，進(jìn)入第一對(duì)四級(jí)桿，而后在第二對(duì)四級(jí)桿中借助碰撞誘導(dǎo)解離作用（collision-induced dissociation）被裂解。
然后，裂解離子產(chǎn)物經(jīng)由ToF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析處理。不論是完全掃描模式（full-scan）還是MS/MS模式，得到的質(zhì)譜圖都具有很高的準(zhǔn)確率和分辨率，這也就意味著能獲得更多的肽段信息，發(fā)現(xiàn)單一同位素信號(hào)（mono-isotopic signal）的離子狀態(tài)和指派（assignment）信息。所有這些信息都給蛋白質(zhì)鑒定工作帶來了極大的便利。有了上述這些信息，再與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，就能找出檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品的資料。Q-Q-ToF質(zhì)譜儀在定量分析方面以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況分析方面的能力也同樣出色。
MALDI技術(shù)是另一項(xiàng)非常有用的待測(cè)蛋白質(zhì)樣品離子化技術(shù)，通常都會(huì)將MALDI技術(shù)與ESI技術(shù)相互補(bǔ)充使用。MALDI質(zhì)譜儀靈敏度非常高，同時(shí)對(duì)樣品污染（比如鹽離子污染或少量去垢劑污染等）的要求沒有ESI質(zhì)譜儀那么苛刻。
最開始，MALDI技術(shù)是與ToF質(zhì)譜儀聯(lián)合使用用來檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量的。后來又被應(yīng)用到Q-Q-ToF質(zhì)譜儀和ToF-ToF質(zhì)譜儀上，這樣才實(shí)現(xiàn)了真正的MS/MS檢測(cè)。在單電荷（singly charged）母離子的質(zhì)譜圖和ToF-ToF質(zhì)譜儀得到的質(zhì)譜圖中都能發(fā)現(xiàn)高能量的碰撞裂解片段，這些片段都是蛋白質(zhì)多肽肽鍵斷裂和側(cè)鏈斷裂形成的，這些信號(hào)都很容易被解析。
離子阱質(zhì)譜儀
在離子阱質(zhì)譜儀（Ion trap, IT）中，可以捕獲離子，因此也可以積累離子。離子阱技術(shù)具有無法比擬的高靈敏度和快速數(shù)據(jù)采集能力。將離子阱技術(shù)與數(shù)據(jù)依賴性采集技術(shù)（data-dependent acquisition）結(jié)合起來，我們就能進(jìn)行高通量的質(zhì)譜檢測(cè)。
不過，離子阱質(zhì)譜儀的分辨率有限，捕獲離子的能力不高，再加上空間電荷效應(yīng)（space-charging effect）的影響，因此離子阱質(zhì)譜儀的檢測(cè)準(zhǔn)確度不夠高。改進(jìn)型的線性離子阱質(zhì)譜儀（linear ion trap analyzers, LIT）具有更高的離子捕獲能力，更寬廣的動(dòng)態(tài)范圍和更高的靈敏度。現(xiàn)在，線性離子阱質(zhì)譜儀已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的四級(jí)桿捕獲設(shè)備。我們通常都會(huì)使用線性離子阱質(zhì)譜儀中的慢速掃描功能來提高分辨率。離子阱質(zhì)譜儀也都具有多階段連續(xù)MS/MS功能，有了這種功能，我們能夠反復(fù)分離、裂解某些離子片段，這是發(fā)現(xiàn)諸如磷酸化等翻譯后修飾情況的好方法。
線性離子阱質(zhì)譜儀技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用到三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（triple quadrupole–type instrument）當(dāng)中，這種新型的質(zhì)譜儀具有了許多新的功能。Q-Q-LIT質(zhì)譜儀就是這種三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，它具有母離子掃描功能和中性丟失掃描功能，同時(shí)該質(zhì)譜儀的敏感度也有所提高（圖1B、C）。
這些新型的質(zhì)譜儀為我們提供了分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況的“利器”。此外，Q-Q-LIT質(zhì)譜儀具有的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)能力（multiple reaction monitoring, MRM）能夠幫助我們發(fā)現(xiàn)母離子與某一片段之間的轉(zhuǎn)換情況。將這種MRM技術(shù)與高效能循環(huán)（high duty cycle）結(jié)合起來，就能獲得無與倫比的敏感性，并且能夠進(jìn)行定量分析。
Ion source：離子源；MS1：第一個(gè)質(zhì)譜儀；CID：碰撞誘導(dǎo)解離；MS2: 第二個(gè)質(zhì)譜儀；
Product ion scanning：離子產(chǎn)物掃描法；fixed:固定；scanning：掃描；m/z：質(zhì)荷比；
Precursor ion scanning: 母離子掃描法；time：時(shí)間；
Neutral loss scanning: 中性丟失掃描法；Multiple ion monitoring: 多離子監(jiān)測(cè)法；
圖1 各種串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法原理示意圖。
A：離子產(chǎn)物掃描法（Product ion scanning）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究里最常用的MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)策略。該方法的目的就是要獲得蛋白質(zhì)片段離子的質(zhì)譜圖，然后據(jù)此鑒定出蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在本試驗(yàn)中，第一個(gè)質(zhì)譜儀MS1是用來篩選出某一特定的母離子。隨后，被選出的母離子在碰撞池中經(jīng)由碰撞誘導(dǎo)解離作用（collision-induced dissociation, CID）被進(jìn)一步裂解成更小的片段，然后這些小片段分子經(jīng)由第二個(gè)質(zhì)譜儀MS2進(jìn)行分析、鑒定。對(duì)不同的母離子反復(fù)進(jìn)行這種分析最終就可以獲得蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列。
B：母離子掃描法。在這里，第二個(gè)質(zhì)譜儀MS2只對(duì)一個(gè)母離子進(jìn)入檢測(cè)。第一個(gè)質(zhì)譜儀MS1對(duì)所有母離子進(jìn)行掃描后挑選出一個(gè)母離子進(jìn)入MS2。通常來說，該方法適用于檢測(cè)某一樣品中包含特殊功能基團(tuán)的蛋白質(zhì)亞群，這些基團(tuán)包括磷酸酯基團(tuán)或糖基化修飾基團(tuán)等。
C：性丟失掃描法（Neutral loss scanning）能夠以同步的（synchronized）方式同時(shí)對(duì)兩種待測(cè)樣品進(jìn)行分析。分子量不同的各種離子可以持續(xù)不斷地通過MS1和MS2。在碰撞池中，不符合分子量要求的中性片段分子都被篩掉了。因此，該方法適用于分析樣品中具有某種特定功能的多肽。該方法最常應(yīng)用的領(lǐng)域是發(fā)現(xiàn)被磷酸化修飾的絲氨酸或蘇氨酸位點(diǎn)。
D：離子監(jiān)測(cè)法（Multiple ion monitoring, RM）是由一系列的實(shí)驗(yàn)組成的。MS1和MS2會(huì)分別挑選出一母離子和一特定的能代表該母離子的片段分子。然后，經(jīng)由一系列的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化操作（母離子——小片段分子配對(duì)操作），最后收集實(shí)驗(yàn)信號(hào)（色譜洗脫時(shí)間）以供結(jié)果分析。MRM方法適合對(duì)復(fù)雜樣品中已知片段特性的特定樣品進(jìn)行分析。
離子回旋加速器與軌道離子阱質(zhì)譜儀
隨著功能強(qiáng)大的帶有外部離子源的傅里葉變換-離子回旋加速器（FT-ICR）質(zhì)譜儀的出現(xiàn)以及商業(yè)化，我們?cè)谫|(zhì)譜儀的分辨率與準(zhǔn)確性方面取得了質(zhì)的飛躍。有了這種新型的質(zhì)譜儀，我們現(xiàn)在可以對(duì)ppm級(jí)乃至亞ppm級(jí)的樣品進(jìn)行分析了。
該質(zhì)譜儀的高分辨率特性不僅提高了數(shù)據(jù)結(jié)果的質(zhì)量，同時(shí)也增加了峰容量（peak capacity），因此相比傳統(tǒng)的低分辨率質(zhì)譜儀，F(xiàn)T-ICR質(zhì)譜儀能夠獲取更多的信息。配有外部LIT設(shè)備的“雜交” FT-ICR質(zhì)譜儀（hybrid FT-ICR instrument）的發(fā)展更是提高了該質(zhì)譜儀的分析能力，同時(shí)也賦予傳統(tǒng)的低分辨率MS/MS質(zhì)譜儀更好的探測(cè)母離子的能力。
將FT-MS質(zhì)譜儀與LIT-ICR“雜交”質(zhì)譜儀結(jié)合，就能獲得真正意義上的平行全質(zhì)譜檢測(cè)儀（parallel full mass spectrum）MS1和串聯(lián)（而非連續(xù)）質(zhì)譜儀（tandem not sequential mass spectrum）MS2。高質(zhì)量的MS1檢測(cè)結(jié)果可以用于定量研究。這種策略唯一的缺點(diǎn)就是相對(duì)比較低的數(shù)據(jù)采集速度（平均每個(gè)循環(huán)只能獲得幾個(gè)數(shù)據(jù)）和IT設(shè)備造成的動(dòng)態(tài)范圍較窄。
最近，出現(xiàn)了一種新型的軌道離子阱（orbitrap）質(zhì)譜儀。這是30年來上市的第一款使用最新物理技術(shù)的質(zhì)譜儀，該質(zhì)譜儀能分離振蕩電場(chǎng)（oscillating electric field）中的離子。在分辨率和準(zhǔn)確率方面軌道離子阱質(zhì)譜儀與FT-ICR質(zhì)譜儀不相上下，但是它不需要FT-ICR質(zhì)譜儀使用的昂貴的超導(dǎo)磁鐵（superconducting magnet）。
MS/MS操作模式
串聯(lián)質(zhì)譜儀通常使用的都是離子模式來鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列（圖1A）。目前所有的MS/MS質(zhì)譜儀都具有該功能。不過表1中列舉的其它特殊的質(zhì)譜儀也具有MS/MS功能。如果要發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中的某個(gè)功能基團(tuán)則需要用到母離子掃描功能或者中性丟失掃描功能，而這就必須用到三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，如Q-Q-Q質(zhì)譜儀，或四級(jí)桿離子阱質(zhì)譜儀，如Q-Q-LIT質(zhì)譜儀。
比如復(fù)雜混合物里的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)就都可以用這種方法（在碰撞池中產(chǎn)生特殊的報(bào)告離子，通過它來進(jìn)行特殊的功能檢測(cè)）檢測(cè)出來。在一個(gè)典型的質(zhì)譜檢測(cè)試驗(yàn)中，首先先用母離子掃描或中性丟失掃描都能發(fā)現(xiàn)目標(biāo)組分，然后再用傳統(tǒng)的MS/MS方法鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及定位修飾位點(diǎn)。
三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀在MRM模式下也能以極高的敏感度進(jìn)行定量分析。已知的或未知的分析物都以極高的敏感度和選擇性能被定量檢測(cè)出來（圖1D）。這種高選擇性得益于質(zhì)譜儀能夠?qū)Υ硪粋€(gè)肽段的一對(duì)母離子和片段裂解物離子進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。而且，在MRM模式下進(jìn)行的兩輪選擇過程會(huì)極大地提高檢測(cè)的靈敏度，因?yàn)榈谝惠喓Y選過后只能剩下很少的離子，這也就將背景噪聲減小到了最低水平。
碰撞誘導(dǎo)解離片段離子（collision-induced dissociation fragment ions, CID）來源于母離子，這些CID離子能夠產(chǎn)生離散信號(hào)，而背景化學(xué)噪聲信號(hào)則是隨機(jī)分布的。最后，由于這種采樣時(shí)間很長(zhǎng)的技術(shù)固有的非掃描本質(zhì)使得它的敏感度非常高，相比離子掃描技術(shù)的探測(cè)極限（LOD）要高出好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
你質(zhì)譜儀的性能
我們已經(jīng)在表1中對(duì)各種質(zhì)譜儀的性能進(jìn)行了一個(gè)概括。總體來說，質(zhì)譜儀的性能包括分辨率、敏感度或探測(cè)極限和準(zhǔn)確性等，這些性能都與質(zhì)譜儀的類型、采用的離子化方法和掃描能力有關(guān)。不過沒有哪一個(gè)儀器能同時(shí)在上述所有方面都全面占優(yōu)，在選擇儀器的時(shí)候必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行相應(yīng)的取舍。
對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器性能的比較一直以來都是一個(gè)存在很多爭(zhēng)議的話題。因?yàn)樾阅苁欠?wù)于需求的，是取決于待測(cè)樣品和實(shí)驗(yàn)步驟的。質(zhì)譜儀對(duì)單獨(dú)肽段樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)敏感度總是很低，不過如果生物樣品的基質(zhì)背景（matrix background）很高，那么檢測(cè)的敏感度就會(huì)提高好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。這種同一款儀器在性能上表現(xiàn)出來的“不穩(wěn)定性”其實(shí)很常見，在儀器處于不同操作條件或狀態(tài)下時(shí)（比如在最優(yōu)條件下，常規(guī)條件下和大批量處理?xiàng)l件下）它們的性能表現(xiàn)都是不同的。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窍脒M(jìn)行定量分析還是蛋白質(zhì)鑒定，這也決定了該使用哪種儀器。在蛋白質(zhì)鑒定試驗(yàn)中，儀器的分辨率（能很好地區(qū)分不同組分）和準(zhǔn)確性是最主要的，而在定量研究中，敏感度、動(dòng)態(tài)范圍和MRM能力才是最主要的。因此，我們應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰约皩?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排來確定該使用哪種質(zhì)譜儀。
要想用全掃描模式（full scanmode）獲取定量數(shù)據(jù)的同時(shí)再用MS/MS模式獲取定性數(shù)據(jù)是一件非常困難的事情。不過某些“雜交”質(zhì)譜儀，比如LIT-ICR質(zhì)譜儀，由于它們能夠平行采集數(shù)據(jù)，因此可以部分解決上面那個(gè)問題。精確的定量分析需要源自整個(gè)洗脫圖（entire elution profile）的高質(zhì)量的、高信噪比的數(shù)據(jù)信息。數(shù)據(jù)質(zhì)量與數(shù)據(jù)采集參數(shù)高度相關(guān)，這些數(shù)據(jù)采集參數(shù)包括掃描時(shí)間或者采樣時(shí)間（對(duì)于非掃描質(zhì)譜儀而言）。因此，我們經(jīng)常需要在數(shù)據(jù)質(zhì)量和樣品處理能力（量）之間做出取舍。
最新進(jìn)展
最近又有幾項(xiàng)有關(guān)質(zhì)譜儀的最新進(jìn)展問世，這些新成果的出現(xiàn)又給我們的生物大分子研究工作補(bǔ)充了“彈藥”。在蛋白質(zhì)測(cè)序方面，基于碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)（CID），又新出現(xiàn)了可變裂解技術(shù)（Alternate fragmentation technique），該新技術(shù)是基于處在碰撞池中的離子具有的電子傳遞特性開發(fā)出來的。目前，電子捕獲解離技術(shù)（ECD）和電子傳遞解離技術(shù)（ETD）都已經(jīng)分別被應(yīng)用到FT-ICR質(zhì)譜儀和LIT質(zhì)譜儀上了。運(yùn)用這兩種技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物能與經(jīng)典的CID方法裂解產(chǎn)物互為補(bǔ)充。
不過這兩種新方法裂解更均勻，更適合用于發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾情況。ECD技術(shù)和ETD技術(shù)還都可以用于大型肽段和蛋白質(zhì)的研究。他們的裂解能力和對(duì)完整蛋白的分析能力可以幫助我們直接用質(zhì)譜儀對(duì)完整的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，即可以采用所謂的“自上而下（top-down）”的方法進(jìn)行研究。這樣，我們能夠獲得完整的氨基酸序列信息和翻譯后修飾信息，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行最準(zhǔn)確的鑒定。
來源：Internet
