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嘉峪檢測網 2024-12-21 11:02
摘 要 / Abstract
中草藥目前是化妝品原料添加的研究熱點，鐵皮石斛是我國傳統中藥材，其提取物可作為化妝品原料，具有抗皺緊致作用。目前大多數提取工藝的產物分子量較大，對于低分子量鐵皮石斛的功效未見相關的研究報道。本實驗通過觀察和比較鐵皮石斛提取物中具有保濕和抗皺功效的基因表達，初步探討其作用機制。本實驗對保濕因子（AQP-3）、透明質酸（HA）和膠原蛋白（COL-I）基因表達含量進行檢測，測試結果表明1%濃度超低分子石斛多糖能夠有效提高這三種基因的表達含量。超低分子石斛多糖可能通過上調膠原蛋白和保濕因子的表達，抑制膠原蛋白降解，改善皮膚屏障和增加皮膚水分，從而減少皮膚老化，發揮抗皺功效。同時，與市售鐵皮石斛提取物相比，1%濃度超低分子石斛多糖在細胞層面具有更好的保濕、抗皺功效。超低分子石斛多糖可作為保濕抗皺的原料，應用于皮膚護理領域。
Chinese herbal medicine is currently a hot research topic of cosmetic ingredient additives. Dendrobium officinale is a traditional Chinese herb, its extract can be used as a cosmetic ingredient and has anti-wrinkle and firming effects. Most of the current extraction processes result in products with larger molecular weights. However, there have been no relevant research reports on the efficacy of low molecular weight Dendrobium officinale. This experiment preliminarily explores its mechanism of action by observing and comparing the expression of genes with moisturizing and anti-wrinkle effects of Dendrobium officinale extract. The experiment detected the genes expression levels of the hyaluronic acid (HA), collagen (COL-I), and aquaporin-3 (AQP-3), and the results showed that ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides (1%) could effectively increase the expression levels of these three genes. Ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides may exert anti-wrinkle effects by upregulating the expression of collagen and moisturizing factors, inhibiting collagen degradation, improving the skin barrier, increasing skin moisture and thus reducing skin aging. Meanwhile, compared with commercially available Dendrobium officinale extracts, ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides at a concentration of 1% have better moisturizing and anti-wrinkle effects at the cellular level. Ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides can be used as moisturizing and anti-wrinkle ingredients and applied to the field of skin care.
關 鍵 詞 / Key words
鐵皮石斛；多糖提取物；促膠原生成；抗皺；雙酶解工藝
dendrobium officinale; polysaccharide extract; promoting collagen synthesis; anti-wrinkle; dual enzymatic process
皮膚皺紋是一系列多因素造成的復雜過程，導致皮膚某些功能及美學改變[1]。隨著年齡增長，多種內部或外部因素導致表皮細胞的增殖活性衰退，表皮變薄[2-3]；真皮膠原蛋白纖維的減少以及基質金屬蛋白酶活化或增多， 導致膠原蛋白的分解和斷裂，進一步引發真皮膠原蛋白纖維束構造紊亂；皮膚中的透明質酸（hyaluronic acid，HA）減少，特別是表皮的保水性變差[4-5]。
目前，已經有大量的研究發現多糖具有顯著的抗衰老作用，多糖結構中含有半縮醛羥基，具有還原作用。有些多糖還可以增強皮膚細胞內抗氧化酶的活性， 從而緩解皮膚氧化損傷， 延緩皮膚衰老[6-9]。近年來的現代藥理藥效學研究發現，鐵皮石斛具有較強的抗氧化、保濕和抗皺等活性。鐵皮石斛多糖作為鐵皮石斛最主要的活性成分促膠原生成、抗氧化功效有著密切的聯系[10]。多糖的生物活性與分子結構、主鏈組成、相對分子量、分支程度、主鏈配置和化學修飾等密切相關[11]。故此，多糖的相對分子量大小會對其活性產生一定影響。
已經有研究表明不同分子量的石斛多糖具有不同的功效， 小分子量的石斛多糖的抗氧化活性更高，這為石斛多糖的抗皺機制奠定了基礎[12-13]。本研究采用特定的酶切工藝，制備小分子量3000Da石斛多糖，評價其體外的抗皺功效，為后續超低分子鐵皮石斛多糖作為功效性化妝品添加劑，開發具有特定功效的化妝品提供了相關的理論依據。
1、實驗部分
1.1 主要材料、實驗試劑和儀器
材料：鐵皮石斛（安徽霍山鐵皮石斛基地，批號20200403），市售鐵皮石斛提取物（博林生物，批號20230707）。
試劑：胎牛血清（FBS）（美國吉布斯生物科技公司，批號20230919），果膠酶（實驗室自研，批號20230302）， 纖維素酶（實驗室自研， 批號20230317），表皮細胞生長因子（EGF）（美國吉布斯生物科技公司，批號20230711），人真皮成纖維細胞（HSF）（北京伊瑞萊生物，批號20230313），pH7.4 緩沖溶液（PBS）（美國吉布斯生物科技公司，批號20230801），高糖培養基（H-DMEM）（美國吉布斯生物科技公司，批號20230801），RNA 提取試劑盒（上海美基生物，批號20230519），逆轉錄試劑盒（日本塔克拉生物， 批號20230519）， 熒光定量PCR 試劑盒（上海碧云天生物，批號20230512），透明質酸ELISA 檢測試劑盒（上海江萊生物，批號20230519），I 型膠原（COL-I）ELISA 檢測試劑盒（南京博研生物，批號20230519）。
儀器：Herocell 180 二氧化碳培養箱（賽默飛世爾科技公司），CKX53 倒置熒光顯微鏡，（日本奧林巴斯有限公司），THZ-D 恒溫搖床（杭州米歐儀器有限公司）， AB204STHZ-D 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司），LC-36 臺式低速離心機（上海安亭科學儀器），VeritiPro PCR 逆轉錄儀（賽默飛世爾科技公司），ABIQS5 實時熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾科技公司），SW-CJ-2FD 超凈工作臺（山東博科有限公司）， 1260 高效液相（HPLC）色譜儀（美國安捷倫公司），-80℃冰箱（海爾DW86L486）。
1.2 實驗方法
1.2.1 超低分子鐵皮石斛多糖制備
將鐵皮石斛洗凈，60℃烘干后機械粉碎。加入超純水，投入鐵皮石斛粉末，投料質量比為1 ∶40。加入纖維素酶在60℃下攪拌1h，隨后升溫至90℃攪拌3h。加入果膠酶，50℃攪拌1h。升溫90℃加熱30min，隨后降溫至40℃，靜置過夜。2.5μl濾膜過濾得到超低分子鐵皮石斛多糖。
1.2.2 超低分子鐵皮石斛多糖分子量和多糖組成
將石斛多糖樣品溶于0.2mol/L NaCl，配制終濃度為2mg/ml。用1ml 的注射器抽起過濾，隨后在HPLC 中進樣。流動相為0.2mol/L NaCl，層析溫度為40℃，流速為0.6ml/min，以右旋糖酐為標準品進行石斛多糖分子量分析測定。將水解后的石斛多糖進樣于凝膠層析柱進行檢測，根據其保留時間值確定多糖組成。
1.2.3 超低分子鐵皮石斛多糖-體外功效評價
1.2.3.1 細胞接種
超低分子鐵皮石斛多糖使用無菌PBS 梯度稀釋，分別配置成1%、0.5%、0.1%的超低分子鐵皮石斛多糖稀釋液（v/v），EGF 使用無菌PBS 配置成10ng/ml 的溶液備用。
取對數期生長的HSF 細胞接種于培養瓶中，待生長至密度超過80%用胰酶消化收集計數。使用完全培養基（90% H-DMEM+9% FBS+1% PS）（v/v）將細胞懸液進行稀釋，按照細胞數1.0 ×105 /孔接種于6 孔板中。置于37℃，5% CO2 培養箱中培養6~12h，使細胞正常鋪展。隨后棄去完全培養基，分為空白組、陽性對照組、實驗組，分別加入對應的條件培養基，培養24h 后分別收集細胞和上清液。空白組：完全培養基（2ml）。陽性對照組：EGF（1ml）+完全培養基（1ml）。實驗組：超低分子鐵皮石斛多糖使用完全培養基。各組分別加入1%、0.5%、0.1%（v/v）濃度的低分子鐵皮石斛稀釋液。
1.2.3.2 透明質酸表達測定
收集細胞上清液，分別用對應的ELISA 試劑盒，根據說明書用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中HA 表達水平。用純化的透明質酸結合蛋白（HABP）包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入HA、生物素化的抗大鼠透明質酸結合蛋白（HABP）、辣根過氧化酶（HRP）標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物3, 3′, 5, 5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色， 并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的透明質酸含量呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
1.2.3.3 水通道蛋白3（AQP-3）和I 型膠原（COL-I）、III型膠原（COL-III）mRNA 表達測定
收集培養后的細胞，按照RNA 提取試劑盒說明書進行操作。在離心管中加入300μl 裂解液（buffer RL ∶DTT =5ml ∶100μl），連續吹打使細胞充分裂解， 加入到過濾柱中， 12000 ×g 離心1min。棄去過濾柱，在收集管中加入330μl 70%乙醇溶液，8000 ×g 離心1min，棄去收集管。將過濾柱套入新收集管，加入600μl RNA 裂解液1，8000 ×g 離心1min。棄去收集管內液體， 加入600μl RNA 裂解液2，8000 ×g 離心1min。棄去液體，空柱在13000 ×g 離心3min。將過濾柱套入無菌無酶離心管中，在過濾柱中心加入15μl 無酶水，靜置1min，10000 ×g 離心1min，棄去過濾柱。
按照試劑盒說明進行逆轉錄，根據樣品RNA 含量加入對應的焦碳酸二乙酯（DEPC）水和樣品量。放入PCR 儀中逆轉錄。運行結束后得到cDNA，放入-80℃冰箱保存。
將逆轉錄的cDNA 用無酶水稀釋10 倍，根據熒光PCR 試劑盒操作說明， 分別測試AQP-3、COL-I 和COL-III 的表達情況，引物詳見表1。
1.2.4 超低分子鐵皮石斛多糖和市售鐵皮石斛提取物對比
1.2.4.1 I 型膠原、III 型膠原的mRNA 表達測定
參照1.2.3.3 測試方案，檢測超低分子鐵皮石斛多糖[1%（v/v）]、市售鐵皮石斛提取物[1%（v/v）]在HSF 細胞中I 型膠原、III 型膠原的表達情況。
1.2.4.2 水通道蛋白3（AQP-3） mRNA 表達測定
參照1.2.2.3 測試方案，對5%（v/v）的超低分子鐵皮石斛多糖、5%（v/ v）市售鐵皮石斛提取物進行水通道蛋白3（AQP-3）mRNA 表達測試。
1.3 統計學分析
所有試驗數據采用GraphPad Prism 8.0 中的one-way ANOVA 方法對數據進行統計差異分析，結果以Mean ± SD 的方式表示，其中 p＜0.05 表示差異具有統計學意義，p越小，差異性越明顯。
2、結果與討論
常規的石斛多糖為大分子物質，過高的分子量可能會使其在針對皮膚使用的過程中無法有效到達作用位點。本研究選擇了酶解的方式，在保證石斛多糖活性的前提下，降低其分子量。針對石斛多糖的單糖組成，篩選了一個雙酶體系，石斛多糖通過該體系進行酶解，能有效的提高活性并且降低分子量。經檢測，其平均分子量為3.66kDa，詳見表2。此外，在石斛多糖酶解后，其主要成分為D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，這對保濕和抗皺是有利的。
皮膚真皮層的主要細胞——成纖維細胞與其分泌的膠原纖維、彈力纖維及基質成分共同構成了真皮的主體，因此成纖維細胞生物學特性的改變，是皺紋形成的根本原因[14]。膠原纖維是皮膚中主要的結構蛋白，也是含量最豐富的蛋白質，對皮膚的彈性和順應性起著重要的作用。透明質酸是廣泛存在于生物體內的一種氨基聚糖， 具有超強的吸水能力，可以吸取自身體積1000 倍的水分，形成一種有彈性的黏性基質填充在組織的空隙內，是維持皮膚組織穩定和彈性的重要細胞外基質[15]。水通道蛋白3（AQP-3）是細胞膜上的一種物質，負責水、甘油及尿素等物質的運輸，屬于一種轉運蛋白因子，主要表達于角質形成細胞和皮膚成纖維細胞。AQP-3 不僅參與皮膚水合、屏障功能， 同時在皮膚損傷和修復、愈合方面，均發揮著重要的作用，是皮膚正常形態和功能維持的重要保障[16]。已有大量研究采用體外檢測手段來評價化妝品原料是否具有相應的功效[17-18]。本實驗通過添加不同濃度的超低分子鐵皮石斛多糖，檢測成纖維細胞透明質酸、膠原蛋白和AQP-3 的含量來驗證超低分子鐵皮石斛多糖對于成纖維細胞的抗皺功效。
2.2 超低分子鐵皮石斛多糖的作用
2.2.1 在HSF 細胞系中對透明質酸生成的影響
HA 在維持細胞外基質、保濕、調節滲透壓方面發揮重要作用。而一旦皮膚中的HA 含量減少，則皮膚的保濕功能減弱， 皮膚會變得粗糙并產生皺紋。另外HA 還具有抗炎作用，當炎癥因子被抑制后，多種彈性金屬蛋白酶下調，這也有助于HA 發揮抗炎作用[19-20]。游離的HA 減少，皮膚的水和能力下降，會導致皮膚組織細胞皺縮、老化，出現皮膚組織形態學改變。1%濃度的超低分子鐵皮石斛稀釋液實驗組較陽性對照組對HA 的含量具有明顯提升（p＜0.05），而濃度為0.5%和0.1%的實驗組與空白對照組相比沒有差異性， 見圖1。這表明1%的低分子鐵皮石斛多糖可以有效的提高HA 的表達水平含量，通過HA 實現改善皮膚保水量，從而間接促進角質層的修復。
2.2.2 在HSF 細胞系中對I 型膠原生成的影響
研究表明，膠原蛋白含量變化是影響皮膚結構狀態的關鍵因素[21]，皮膚老化會導致I 型膠原蛋白（COL-I）和III 型膠原蛋白（COL-III）減少，其發生機制涉及到膠原蛋白合成與分解。超低分子鐵皮石斛多糖能夠促進細胞的新陳代謝，加快皮膚細胞核酸和蛋白質的合成，刺激皮膚成纖維細胞的活性，促進膠原蛋白合成，降低皮膚成纖維細胞凋亡率，從而延緩皮膚衰老和皺紋的發生。其中濃度為1%的超低分子鐵皮石斛多糖對于COL-I 生成具有較好的促進作用， 且具有統計學差異（p＜0.05），而0.5% 和0.1% 與空白對照組相比沒有差異性，見圖2。
2.2.3 在HSF 細胞系中對AQP-3 生成的影響
已有大量的實驗研究表明導致皺紋的產生原因之一是皮膚水分流失[22-23]，造成皮膚干燥，從而對皮膚產生不可逆的損傷。水從基底組織擴散到角質層，并誘導角質層的進一步水合作用，在這個過程中，皮膚水分不斷滲透進入基底層。AQP-3 是維持皮膚水合作用的重要轉運蛋白，參與細胞物質的吸收和分泌，有助于維持彈性和修復損傷[24]。1%的實驗組相較于空白對照組AQP-3 的mRNA 水平明顯降低（p＜0.05），見圖3。超低分子鐵皮石斛多糖具有大量能與水分子結合的羥基和羧基等極性基團，從而使其具有吸水性。同時超低分子鐵皮石斛多糖能夠打開皮膚的水合通道，促進水分子在皮膚的轉運，進而改善皮膚含水量，提升保濕功能減少皺紋產生。
2.3 超低分子鐵皮石斛多糖與市售鐵皮石斛提取物的對比
2.3.1 I 型膠原、III 型膠原mRNA 表達比較
超低分子鐵皮石斛多糖能夠促進細胞的新陳代謝，刺激皮膚成纖維細胞的活性，加快皮膚表皮和真皮細胞中DNA 的合成與轉錄，促進膠原蛋白合成，抵抗外界刺激誘導的凋亡，從而延緩皮膚衰老和皺紋的發生。當濃度為1%時，超低分子鐵皮石斛多糖對于COL-I、COL-III 生成具有明顯的促進作用（p＜0.05），同時，其促進COL-I、COL-III 的作用顯著優于同等檢測條件下的市售鐵皮石斛提取物，具有顯著性差異（p＜0.05），見圖4 和圖5。
2.3.2 AQP-3 mRNA 表達比較
超低分子鐵皮石斛多糖在濃度1%時，可顯著上調AQP-3 的基因表達（p＜0.001），且與市售鐵皮石斛提取物相比，在相同濃度下，超低分子鐵皮石斛多糖上調AQP-3 mRNA 表達的效果更好，表明超低分子鐵皮石斛多糖在體外具有更優的保濕作用，見圖6。
3、結 論
皮膚老化與表皮角質層屏障功能的喪失和水分含量減少有關，修復角質層屏障和保持皮膚高水合作用是改善光老化的重要因素，維持表皮角質層的最佳水合作用水平很大程度上取決于角質化包膜的成分和天然保濕因子。膠原蛋白是維持皮膚飽滿充盈的物質基礎，I 型膠原約占皮膚膠原成分80%。同時，AQP-3 和HA 又是維持皮膚角質層水合的重要因素。因此為了研究超低分子鐵皮石斛多糖是否能保護HSF 細胞起到皮膚屏障功能，從而在表觀上減少皺紋的產生，本實驗采用實時熒光PCR技術和ELISA 技術測定了上述相關標志物。通過研究發現，超低分子鐵皮石斛多糖可以提高HA 和COL-I 的表達，并且恢復AQP-3 的轉錄水平。根據實驗結果，超低分子鐵皮石斛多糖改善皮膚角質屏障和皮膚水分的最低起效濃度為1%，說明超低分子鐵皮石斛多糖可能通過改善皮膚屏障和增加皮膚水分從而減少皮膚皺紋。對比市售鐵皮石斛提取物，在1%檢測濃度下，超低分子鐵皮石斛多糖具有更好的促進膠原蛋白基因表達及上調AQP-3 基因的能力，表明超低分子鐵皮石斛多糖在抗皺功效上優于市售鐵皮石斛提取物。
目前市面上抗皺日化用品和功效型化妝品的效果不理想， 超低分子鐵皮石斛多糖以其獨特的優勢，在體外層面呈現了顯著的抗皺效果，為抗皺研究提供了新思路。
來源：中國食品藥品監管雜志
