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嘉峪檢測網 2025-04-29 15:57
雙光子顯微鏡（Two-photon microscope，TPM）作為一種基于非線性光學效應的高分辨率三維成像技術，近年來在化妝品功效評價領域展現出顯著的應用潛力。其核心優勢在于無創、在體、原位、無標記的實時成像能力，能夠深入皮膚組織觀察細胞及胞外基質的動態變化，為化妝品的安全性和功效性評價提供了科學依據。以下是其具體應用及技術特點：
一.技術原理與優勢
1. 深層成像能力
雙光子顯微鏡利用長波長（通常780-1300nm）激光激發，減少組織散射和吸收，成像深度可達200μm以上（單光子共聚焦顯微鏡僅約100μm，三光子顯微鏡可達500μm左右），能夠清晰呈現皮膚表皮至真皮淺層的結構。
例如，可觀察到角蛋白、膠原纖維、彈性纖維、黑色素等物質的分布，以及NAD(P)H/FAD等代謝標志物的自發熒光信號。
圖1. 角質層：典型的角質層圖像特點是呈現不規則狀，邊緣清晰，能觀察到暗溝或亮線
圖2. 顆粒層：由稍微扁平的角質形成細胞組成，可以觀察到明顯的細胞、細胞核結構，觀察是否排列規整，無空洞缺損部位
圖3. 棘層：由多邊形的角質形成細胞組成，可以觀察到蜂巢狀緊密排列的細胞，細胞形態呈現多邊形。與顆粒層相比，棘層的細胞大小顯著減小
圖4. 基底層：基底細胞色素環包裹真皮乳頭，在3D層掃時可以觀察到環形結構，環形結構內部一般是膠原纖維，環繞在膠原纖維周圍的一圈細胞為基底細胞層
圖5. 真皮層彈性纖維：在基底細胞層下方觀察到，呈網狀結構，采集時需注意到達此層若出現毛囊空洞需重新采集
圖6. 真皮層膠原纖維：紋理結構，呈現條帶狀或網狀，采集時需注意到達此層若出現毛囊空洞需重新采集
（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評價實驗室）
2. 高分辨率與多模態成像
• 水平分辨率≤0.8μm，可分辨單個細胞及胞外基質形態（如膠原纖維的排列）。
• 結合雙光子熒光（TPEF）和二次諧波（SHG）技術，分別檢測代謝物質，如NAD(P)H和膠原纖維，實現多參數量化分析。
3. 無創性與實時動態監測
• 無需切片或染色，避免傳統組織學方法對樣本的破壞，支持同一部位長期追蹤，適用于化妝品功效的時間序列評價。
圖7. a) 傳統顯微觀察：需切片+染色（圖源來自網絡）
圖7. b) 雙光子顯微鏡：雙通道天然水平光學切片成像
（圖源來自CIRS化妝品功效臨床評價實驗室）
注：雙通道指自發熒光通道：角蛋白（角質層）、NAD(P)H&FAD（活角質形成細胞）、彈性纖維（網狀真皮層）、黑色素（基底層）；二次諧波通道：膠原纖維（網狀真皮層）。
二.在化妝品功效評價中的具體應用
1. 皮膚屏障與保濕功效評估
• 通過監測角質層厚度、細胞間脂質排列及水分分布，評估保濕類產品的修復效果。例如，對比使用產品前后皮膚表層角蛋白熒光強度的變化，量化保濕效果。
圖8. a) 使用產品28天后，角質層表層形態趨于平整（可見空洞減少，角質層形成細胞排列趨于均勻）
圖8. b) 使用產品28天后，上表層逐漸增厚（虛線為真表皮交界處）
（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評價實驗室）
2. 微針創傷檢測
利用醫美微針壓刺手臂皮膚之后，用雙光子檢測微針創口。
圖9. 角質層存在明顯的不規則創口，網狀纖維層對應位置出現無信號區，說明微針刺穿了基底層
（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評價實驗室）
3. 抗衰老與緊致功效研究
• 膠原纖維成像：SHG通道可直觀顯示膠原纖維的密度和排列變化，評估抗皺產品的功效。
圖10. SHG通道膠原纖維—平面圖像
D0
D28
圖11. SHG通道膠原纖維—立體圖像
（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評價實驗室）
注：
- 膠原纖維屬于功能性蛋白質，較粗大，直徑1~20μm成束狀分布，排列緊密，并交織成網狀。
- 雙光子膠原纖維的掃描可觀察深度一般為40μm，甚至更深。
- 可以在二次諧波通道觀察到膠原纖維（紅色），平面圖像主要特征為紋理結構，呈現條帶狀或網狀，立體圖像由于不同深度的膠原纖維疊加，主要呈現為立體網狀或蓬松的云狀結構。
圖12. 監測表皮層厚度變化
注：隨回訪周期變化：使用產品28天后，上表皮厚度顯著改善8.45%；0μm處為角質層表面；0~40μm處為表皮層；50~60μm處（圖示虛線處）為真表皮交界處，紅色膠原纖維出現處，可認為是真皮最淺，綠色細胞結構消失處，可認為是表皮最深；60~120μm處為真皮淺層，紅色信號為膠原纖維，綠色信號為彈性纖維。
圖13. 熒光通道&二次諧波通道—立體圖像
（以上雙光子圖源來自CIRS化妝品功效臨床評價實驗室）
• 代謝活性分析：NAD(P)H/FAD熒光強度比值反映細胞代謝狀態，間接評價抗氧化和抗衰老效果。
4. 安全性評價
•觀察化妝品成分對皮膚細胞的光毒性或炎癥反應（如細胞形態異常、熒光信號異常增強）。
三.行業應用方向
化妝品功效評價應用方向：化妝品人體功效方法開發，如基于雙光子激發技術的皮膚纖維形態測試方法的探究，并將其應用于人群皮膚基礎調研，文獻有記載雙光子分析真皮纖維網格的形態特征隨年齡的變化，并定義了真皮形態學評分體系MDMS（MLT-based Dermis Morphology Score）；在體評價皮膚老化，并定義了真皮老化指數SAAID（SHG-to-AF aging index of dermis）；化妝品成分作用機理的研究與探索，如膠原蛋白刺激類產品的功效驗證等。
醫美功效評價應用方向：激光美容功效評價、人體細胞活性檢測、人體皮膚膠原纖維可視化評估、人體皮膚彈性纖維可視化評估等。如評估點陣激光刺激彈性纖維和膠原纖維生成。
參考文獻
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來源：Internet
