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嘉峪檢測網 2025-04-18 20:42
摘 要： 建立高效液相色譜法同時測定化妝品中25種美白成分。化妝品樣品經體積分數為50%的甲醇溶液超聲提取，用聚四氟乙烯濾膜過濾，Thermo Scientific AcclaimTM 120（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱梯度洗脫分離，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。25種美白成分的質量濃度在0.4～392.5 μg/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，線性相關系數均大于0.999，在水基、乳劑、粉劑、面膜、凝膠5種基質中的檢出限為0.4～41.4 μg/g，定量限為1.3～138.1 μg/g。樣品加標平均回收率為92.6%～109.7%，測定結果的相對標準偏差為0.3%～4.8%（n=6）。該方法可用于多種化妝品基質中25種美白成分的測定。
關鍵詞： 化妝品； 祛斑； 美白； 高效液相色譜法
“一白遮百丑”是根植于我國人民心中的審美標準，消費者對于祛斑美白類產品的需求也與日俱增。然而隨著祛斑美白類產品的日益繁榮，該類產品也暴露出一些問題。歐盟消費者安全科學委員會(SCCS)先后于2008年、2012年、2021年發布了風險評估報告——SCCP/1182/08[1]、SCCP/1481/12[2]、SCCS/1637/21[3]。報告顯示，使用質量分數為1%的曲酸會對消費者的健康構成風險。曲酸具有潛在的致敏風險，最高質量分數為0.7%時對消費者是安全的[4]，目前祛斑美白類化妝品的安全風險引起了人們的廣泛關注[5?7]。
我國《化妝品監督管理條例》將祛斑美白化妝品按特殊化妝品管理，明確規定祛斑美白類化妝品和具有祛斑美白功能的化妝品新原料由國務院藥品監督管理部門實行注冊管理[8]。目前，我國尚未明確祛斑美白類原料清單，《化妝品安全技術規范》(2015年版)[9](以下簡稱《規范》)中禁止添加汞、氫醌和苯酚，但絕大部分美白成分沒有禁限值，且檢測方法、評價方法不夠完善。目前關于美白成分的檢測標準有GB/T 35954—2018《化妝品中10種美白祛斑劑的測定 高效液相色譜法》和《規范》8.1“化妝品中抗壞血酸磷酸酯鎂等11種原料的檢驗方法”及8.2“化妝品中α-熊果苷等4種原料的檢驗方法”[10]等。文獻報道的關于美白成分的檢測方法有高效液相色譜法[11?13]、膠束電動毛細管色譜法[14]、高效液相色譜-串聯質譜法[15]等，但這些檢測方法檢測組分較少，適用范圍較窄，而已知具有美白功效的原料有上百種，目前的檢測標準遠不能滿足監管需求。筆者以水基、膏霜乳、凝膠、粉劑、面膜等基質樣品為考察對象，采用適用性廣、特異性強、靈敏度高的高效液相色譜法檢測化妝品中25種美白成分，基本覆蓋市場上絕大多數化妝品劑型。該方法覆蓋面廣、靈敏度高、操作簡便，并應用于市場上實際樣品的檢測，以期了解我國祛斑美白類化妝品市場中美白成分的添加情況，為監管部門打擊化妝品虛假添加行為及祛斑美白類化妝品的質量控制提供技術支撐。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國賽默飛世爾科技公司。
電子分析天平：TB-215D型，感量為0.01 mg，美國丹佛儀器公司。
超聲波清洗器：PM5-2000TD型，英國普律瑪儀器有限公司。
臺式冷凍離心機：MULTI-FUGE X1R型，美國賽默飛世爾科技公司。
渦旋振蕩器：IKA®型，廣州儀科實驗室技術有限公司。
甲醇：色譜純，美國霍尼韋爾公司。
磷酸二氫鉀、氫氧化鉀：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
抗壞血酸磷酸酯鎂[M1，純度(質量分數，下同)為92.5%，批號為2353934]、抗壞血酸葡糖苷(M2，純度為99.8%，批號為2360467)、5-丙基間苯二酚(M16，純度為97.0%，批號為F3710201)、苯乙基間苯二酚(M18，純度為99.7%，批號為2360046)、光甘草定(M22，純度為99.6%，批號為2102232)標準品：安譜璀世標準技術服務有限公司。
4-甲氧基水楊酸鉀(M5，純度為95.0%，批號為Y11J9G65058)、覆盆子酮葡糖苷(M13，純度為98.0%，批號為B13A8L33441)、二甲氧基甲苯基-4-丙基間苯二酚(M20，純度為98.0%，批號為M28HT 180825)標準品：上海源葉生物科技有限公司。
煙酸(M3，純度為99.8%，批號為100434-201603)、鞣花酸(M6，純度為88.8%，批號為111959-201903)、熊果苷(M7，純度為99.7%，批號為111951-201301)、阿魏酸(M11，純度為99.3%，批號為110773-202316)、氫醌(M23，純度為99.8%，批號為190116-201501)、水楊酸(M24，純度為99.8%，批號為100106-202106)、紅景天苷(M12，純度為100.0%，批號為110818-202210)標準品：中國食品藥品檢定研究院。
曲酸(M8，純度為99.6%，批號為E0024193)、3-鄰-乙基抗壞血酸(M4，純度為97.9%，批號為G0062566)、苯酚(M14，純度為99.7%，批號為F0057703)、己基間苯二酚(M21，純度為99.6%，批號為D0047686)標準品：北京曼哈格生物科技有限公司。
煙酰胺(M9，純度為99.29%，批號為G1136756)、間苯二酚(M10，純度為99.8%，批號為G880174)標準品：德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司。
漢黃芩素(M19，純度為96.1%，批號為1024-RD-0042)、4-正丁基間苯二酚(M17，純度為97.9%，批號為0813-RC-0015)、白藜蘆醇(M25，純度為100.0%，批號為1226-RD-0050)標準品：廣州佳途科技股份有限公司。
杜鵑醇(M15，純度為95.0%，批號為1024-RD-0045)標準品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
實驗用水為一級水。
化妝品樣品：市售。
1.2 溶液配制
1.2.1 標準儲備液
精密稱取除鞣花酸以外的24種標準品20～200 mg分別至5～20 mL容量瓶中，加入相應溶劑(M1、M2、M4、M5、M8、M9、M13用水作為溶劑，M3、M7、M10～M12、M14～M25用甲醇作為溶劑)溶解并定容至標線，搖勻，制得質量濃度為1～6 g/L的標準儲備液。
稱取鞣花酸標準品約20 mg至100 mL容量瓶中，先加入少量1 g/L氫氧化鉀溶液溶解，用甲醇稀釋，再用1 g/L氫氧化鉀溶液調節pH至10.0左右，用甲醇定容至標線，搖勻，制得質量濃度為0.2 g/L的標準儲備液。
1.2.2 系列標準溶液
精密量取上述除熊果苷、阿魏酸、鞣花酸外的其余22種美白成分標準儲備液0.05～1.5 mL至同一只10 mL容量瓶中，用50% (體積分數，下同)甲醇溶液定容至標線，制得22種美白成分混合標準溶液。精密量取22種美白成分混合標準溶液0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5 mL至6只10 mL容量瓶中，分別用50%甲醇溶液定容至標線，配成系列質量濃度的22種美白成分標準工作溶液。
為了擴大方法覆蓋面，新增《規范》8.1和8.2中的熊果苷、阿魏酸、鞣花酸3種組分。由于時間有限未進一步研究，而是將這3種組分配制成混合標準溶液進行方法學研究。精密量取熊果苷、阿魏酸、鞣花酸3種標準儲備液1、0.1、3 mL至同一只10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至標線，制得3種美白成分混合標準溶液。精密量取3種美白成分混合標準溶液0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5 mL至6只10 mL容量瓶中，分別用50%甲醇溶液定容至標線，配成系列質量濃度的3種美白成分混合標準工作溶液。
1.3 樣品處理
稱取樣品0.5 g (精確到0.001 g)，置于10 mL具塞離心管中，加入50%甲醇溶液約8 mL，渦旋30 s，超聲提取20 min，冷卻至室溫，用50%甲醇溶液定容至標線，搖勻，以10 000 r/min轉速離心10 min，上清液經0.45 μm濾膜過濾，濾液作為樣品溶液。
1.4 色譜條件
色譜柱：Thermo AcclaimTM 120 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；流動相：A相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用100 g/L氫氧化鉀溶液調節pH值為6)，B相為甲醇；檢測波長：M1～M6為254 nm，M7～M22為270 nm，M23～M25為300 nm；流量：1.00 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：10 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab.1 Gradient elution procedure
1.5 測定方法
在1.4色譜條件下，分別測定系列混合標準工作溶液和樣品溶液，以標準溶液的質量濃度為橫坐標，
對應的色譜峰面積為縱坐標，繪制各組分的標準工作曲線，用外標法定量。
2. 結果與討論
2.1 色譜柱選擇
分別對比了4種不同品牌色譜柱的分離效果，色譜柱信息見表2。結果表明，1＃～3＃色譜柱對曲酸和熊果苷、苯乙基間苯二酚和漢黃芩素的分離效果不佳，色譜峰形較差，且3＃色譜柱不耐受，使用3天后色譜峰有拖尾現象，且基線波動較大。4＃色譜柱(Thermo Scientific AcclaimTM 120)對25種組分的分離效果均較好，且色譜峰形良好，因此選擇Thermo Scientific AcclaimTM 120 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。
表2 色譜柱信息
Tab.2 Chromatographic column information
2.2 檢測波長選擇
在190～400 nm波長范圍內對25種組分進行掃描，選擇各組分最大吸收光譜。綜合考慮，選擇檢測波長分別為M1～M6：254 nm，M7～M22：270 nm，M23～M25：300 nm。
2.3 流動相優化
根據文獻[10]和文獻[12]，有機相多為甲醇，水相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，在該流動相條件下各組分圖譜峰形較好，只有個別組分難以完全分離。在試驗過程中發現，流動相pH值對化合物的穩定性和分離度有影響。目標化合物多含有酚羥基或羧基而顯酸性，因而采用酸性流動相，但pH值太低熊果苷和氫醌不穩定。用100 g/L氫氧化鉀調節流動相pH值，考察了不同pH值(4.5、5.5、6.0)對色譜分離的影響，結果如圖1所示。由圖1可以看出，當pH值為6.0時，4-正丁基間苯二酚、苯乙基間苯二酚和漢黃芩素，二甲氧基甲苯基-4-丙基間苯二酚和己基間苯二酚能夠達到基線分離，且其他組分無干擾，綜合考慮選擇流動相pH值為6.0。
圖1 流動相不同pH值時的色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of the mobile phase at different pH values
1—曲酸； 2—煙酰胺； 3—間苯二酚； 4—紅景天苷； ；5—覆盆子酮葡糖苷； 6—苯酚； 7—杜鵑醇； 8—5-丙基間苯二酚； ；9—4-正丁基間苯二酚； 10—苯乙基間苯二酚； 11—漢黃芩素； ；12—二甲氧基甲苯基-4-丙基間苯二酚； 13—己基間苯二酚； ；14-光甘草定
2.4 濾膜選擇
分別考察了聚醚砜(PES)、親水聚偏氟乙烯(PVDF)、疏水聚四氟乙烯(PTFE)、親水PTFE和尼龍66這5種材質的濾膜對目標組分的吸附作用，結果如圖2所示。由圖2可以看出，不同材質的濾膜對不同組分的吸附量影響較大，尤其是用尼龍66材質的濾膜過濾后，部分組分(如M1、M5、M24、M25)的剩余量低于50%。綜合結果來看，無論疏水PTFE材質還是親水PTFE材質的濾膜對25種組分吸附量均較少，過濾效果優于另外3種材質，因此選擇PTFE材質的濾膜過濾待測樣品溶液。
M1—抗壞血酸磷酸酯鎂； M2—抗壞血酸葡糖苷； M3—煙酸；M4—3-鄰-乙基抗壞血酸； M5—4-甲氧基水楊酸鉀； M6—鞣花酸；M7—熊果苷； M8—曲酸； M9—煙酰胺； M10—間苯二酚；M11—阿魏酸； M12—紅景天苷； M13—覆盆子酮葡糖苷；M14—苯酚； M15—杜鵑醇； M16—5-丙基間苯二酚；M17—4-正丁基間苯二酚； M18—苯乙基間苯二酚；M19—漢黃芩素； M20—二甲氧基甲苯基-4-丙基間苯二酚；M21—己基間苯二酚； M22—光甘草定； M23—氫醌；M24—水楊酸； M25—白藜蘆醇圖2 不同材質濾膜過濾后25種美白成分的剩余量
Fig. 2 Remaining amount of 25 whitening ingredients filtered by different material filter membranes
2.5 色譜圖
分別取空白樣品溶液、22種美白成分混合標準溶液、3種美白成分混合標準溶液及加標樣品溶液，按1.4色譜條件進行測定，色譜如圖3～圖5所示。結果表明，空白樣品溶液無干擾，加標樣品溶液和混合標準溶液保留時間一致，色譜峰形和分離效果良好，表明該方法具有良好的專屬性。
圖3 空白樣品溶液色譜圖
Fig. 3 Chromatograms of blank sample solution
圖4 25種美白成分混合標準溶液色譜圖
Fig. 4 Chromatograms of 25 whitening ingredients
1—抗壞血酸磷酸酯鎂； 2—抗壞血酸葡糖苷； 3—煙酸； 4—3-鄰-乙基抗壞血酸； 5—4-甲氧基水楊酸鉀； 6—鞣花酸； 7—熊果苷； 8—曲酸； 9—煙酰胺； 10—間苯二酚； 11—阿魏酸；12—紅景天苷； 13—覆盆子酮葡糖苷； 14—苯酚； 15—杜鵑醇； 16—5-丙基間苯二酚； 17—4-正丁基間苯二酚； 18—苯乙基間苯二酚； 19—漢黃芩素； 20—二甲氧基甲苯基-4-丙基間苯二酚； 21—己基間苯二酚； 22—光甘草定； 23—氫醌； 24—水楊酸； 25—白藜蘆醇
mixed standard solution
圖5 25種美白成分加標樣品溶液色譜圖
Fig. 5 Chromatograms of 25 whitening ingredients
1—抗壞血酸磷酸酯鎂； 2—抗壞血酸葡糖苷； 3—煙酸； 4—3-鄰-乙基抗壞血酸； 5—4-甲氧基水楊酸鉀； 6—鞣花酸； 7—熊果苷； 8—曲酸； 9—煙酰胺； 10—間苯二酚； 11—阿魏酸； 12—紅景天苷； 13—覆盆子酮葡糖苷； 14—苯酚； 15—杜鵑醇； 16—5-丙基間苯二酚； 17—4-正丁基間苯二酚； 18—苯乙基間苯二酚； 19—漢黃芩素； 20—二甲氧基甲苯基-4-丙基間苯二酚； 21—己基間苯二酚； 22—光甘草定； 23—氫醌； 24—水楊酸； 25—白藜蘆醇
spiked sample solution
2.6 線性方程、檢出限與定量限
取22種美白成分系列混合標準溶液和3種美白成分系列混合標準溶液，在1.4色譜條件下進行測定，以目標化合物的質量濃度為橫坐標(x)，以對應的色譜峰面積為縱坐標(y)，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數。逐級稀釋25種美白成分混合標準溶液，按1.4色譜條件測定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應的質量濃度作為方法檢出限和定量限，根據取樣質量和定容體積換算成樣品中的含量，以質量分數(μg/g)表示。25種美白成分的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限見表3。
表3 25種美白成分的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限
Tab. 3 Linear ranges of mass concentration，linear equations，correlation coefficients，detection limits，and quantification limitsof 25 whitening ingredients
2.7 加標回收與精密度試驗
選擇水基類、乳劑類、粉劑、面膜類、凝膠類5種基質化妝品空白樣品，分別添加25種美白成分混合標準溶液，按1.3方法每種基質分別平行制備6份加標樣品溶液，按1.4色譜條件測定，計算回收率和測定結果的相對標準偏差(RSD)，結果見表4。由表4中可知，25種美白成分平均回收率為92.6%～109.7%，測定結果的相對標準偏差為0.3%～4.8%，符合《化妝品中禁用物質和限用物質檢測方法驗證技術規范》的要求。表明該方法具有良好的準確性和精密度，且適用于大多數基質化妝品的檢測。
表4 樣品加標回收與精密度試驗結果(n=6)
Tab. 4 Results of samples spiked recovery and precision test (n=6)
2.8 穩定性試驗
取經處理后的水基類加標樣品溶液，于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24、48、72 h進行測定，記錄各組分的色譜峰面積，計算測定結果的相對標準偏差。結果顯示，25種美白成分色譜峰面積測定結果的相對標準偏差為0.6%～8.1%，表明樣品溶液在3天內穩定性良好。
3. 結語
建立了高效液相色譜法同時測定祛斑美白類化妝品中25種美白成分的分析方法。該方法樣品處理簡單、操作方便、準確度高、重復性好、覆蓋組分
多，能夠滿足大部分美白祛斑劑的同時測定，且可用于水基、膏霜乳、凝膠、粉劑、面膜5種基質化妝品的測定，基本覆蓋了絕大多數化妝品劑型，具有良好的應用前景，可為監管部門打擊化妝品虛假添加行為及祛斑美白類化妝品的質量控制提供技術支撐。
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引用本文： 吳姣嬌，趙薇，潘小紅，等 . 高效液相色譜法同時測定化妝品中25種美白成分［J］. 化學分析計量，2025，34（1）： 26. (WU Jiaojiao, ZHAO Wei, PAN Xiaohong, et al. Simultaneous determination of 25 whitening ingredients in cosmetics by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 26.)
來源：化學分析計量
