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魚肝油中的維生素D3的測(cè)定方法

本文對(duì)樣品提取溶劑和提取方法進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，簡化樣品前處理步驟，此方法具有簡便易行、精密度高、回收率高的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（日本島津，LC-20AT 泵，SPD- 20 AV 檢測(cè)器）；LC Solution 色譜工作站 （日本島津）；恒溫 SHA-CA 水浴振蕩器、電子分析天平：金壇市國旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；WSL-2A 比較測(cè)色儀：上海現(xiàn)科儀器有限公司；SZC-C 脂肪測(cè)定儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷（均為分析純）；正己烷、異丙醇（均為色譜純）；VD3 標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma；魚肝油為抽檢樣品。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Rx-SIL（5 μm，4.6 mm× 250 mm）；流動(dòng)相：正己烷：異丙醇（體積分?jǐn)?shù)比）95∶5；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：264 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：100 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取 10.00 mg 的 VD3 標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中，搖勻，得到濃度為 100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取 5.00 g 樣品于 100 mL 的容量瓶中，先用適量正己烷使其溶解，再用正己烷定容至刻度，劇烈振蕩 2 min，靜置分層，取上層有機(jī)相過 0.45 μm 的有機(jī)濾膜備用，以供液相分析。

2 分析與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長的確定

參照文獻(xiàn)可知，運(yùn)用紫外掃描儀進(jìn)行圖譜掃描，得出此條件下的最大吸收波長為 264 nm。

2.2 流動(dòng)相的確定

對(duì)以下幾種正己烷∶異丙醇（體積分?jǐn)?shù)比）80∶20、 85∶15、90∶10、95∶5 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，綜合考慮色譜峰、保留時(shí)間、分離效果得出最佳流動(dòng)相比例為正己烷∶異丙醇體積分?jǐn)?shù)比（體積分?jǐn)?shù)比）95∶5。

2.3 柱溫的確定

柱溫升高的同時(shí)，極性和非極性溶質(zhì)的容量因子會(huì)隨著減小，從而會(huì)縮短保留時(shí)間。柱溫并不是越高越好，在整個(gè)的升溫過程中可得到塔板高的一個(gè)最小值，此時(shí)的柱效達(dá)到最高[10]。結(jié)合儀器本身其它部件的耐受程度，最終確定最佳柱溫為 40 ℃。

2.4 流速的確定 因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于廠家來說，每一根特 定的色譜柱，都對(duì)應(yīng)有一個(gè)最佳流速。本實(shí)驗(yàn)的最佳流速為1.0 mL/min。

2.5 樣品溶劑的確定

本實(shí)驗(yàn)研究的是從魚肝油中提取 VD3 ，因?yàn)?VD3 是脂溶性的，易溶于有機(jī)溶劑，因此嘗試直接用有機(jī)溶劑溶解樣品，稀釋上機(jī)。又考慮到樣品本身對(duì)色譜柱的影響，要求每次進(jìn)樣的樣品濃度低于 10 g/100 mL。

在溶劑的選擇上，分別用丙酮、石油醚、正己烷、乙 酸乙酯溶解油樣，定容，過 0.45 μm 的有機(jī)濾膜上機(jī)。

測(cè)量的結(jié)果顯示乙酸乙酯誤差最大，丙酮、正己烷、石 油醚無明顯差異。同時(shí)考慮到溶劑本身對(duì)色譜柱的影響，綜合分析得出正己烷作為溶劑最合適，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn) 確，對(duì)柱子的損壞最小。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的色譜圖

根據(jù)檢測(cè)波長、流動(dòng)相、流速、柱溫等色譜條件討論，參考標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.9-2010《嬰幼兒食品和乳品中維 生素  A、D、E》的測(cè)定中給出VD的進(jìn)樣量，得出最佳色譜條件為檢測(cè)波長 264 nm、流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇（體積分?jǐn)?shù)比）95∶5、柱溫40℃、流速為1.0 mL/min、進(jìn)樣量 100 μL。

取抽檢的魚肝油按照 1.3.3 的要求制備樣品溶液， 同時(shí)按 1.3.2 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，選擇的上述最佳色譜條件對(duì)樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，以保 留時(shí)間定性和外標(biāo)法定量，得出的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的色譜圖如圖1 和圖 2。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限的確定

準(zhǔn)確吸取VD3的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.20、0.80、2.00、5.00、20.00 mL 于 100mL 棕色容量瓶中，用分析純正己烷溶解定容至刻度混勻。得到濃度分別為0.20、0.80、2.00、 5.00、20.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照本方法的最佳色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為橫坐標(biāo)，以 VD3的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)以3倍儀器響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來計(jì)算儀器的檢測(cè)限，10 倍噪音比來確定定量限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方

法的靈敏度較高，能滿足實(shí)際測(cè)定的要求。其結(jié)果見表 1。

2.8 精密度和回收率的測(cè)定

采用本方法對(duì)抽檢的已知VD3含量的魚肝油中加入高、中、低 3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量4 次求平均值進(jìn)行精密度和回收率測(cè)定，其結(jié)果見表2。

由表 2 可知，采用本方法測(cè)得的數(shù)據(jù)結(jié)果表明其回收率和精密度都達(dá)到了很高的要求。平均回收率為94.2 %，RSD 為 0.62 %，結(jié)果可靠。

2.9 不同來源的魚肝油中 VD3的含量測(cè)定

以抽檢的幾批不同廠家的魚肝油為研究對(duì)象，運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)的最佳色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量，其結(jié)果見表3。

由表 3 的測(cè)量結(jié)果顯示，抽檢的不同廠家的魚肝油中 VD3的含量存在明顯的差異，甚至同一廠家的不同批次的魚肝油中 VD3含量也有明顯差異，這可能跟原料的處理、加工工藝等因素有關(guān)。

3 結(jié)論

本文建立了一種新的快速測(cè)定魚肝油中VD3含量的分析方法。通過對(duì)色譜柱、檢測(cè)波長、流動(dòng)相、流速等多個(gè)影響因素進(jìn)行詳細(xì)分析最終得出最佳的色譜條件。該方法中 VD3濃度在 0.2 μg/mL～20 μg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與含量具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.62 %，平均回收率為 94.2 %。同時(shí)對(duì)樣品的前處理進(jìn)行了很大的改進(jìn)，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確驗(yàn)證，得出此方法具有簡便易行、分離效果好、精密度高、回收率高的特點(diǎn)。