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嘉峪檢測網 2025-04-07 20:21
摘 要： 建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定干血斑中維生素A和維生素E的含量。樣品經純化水超聲提取，甲醇沉淀蛋白，乙酸乙酯萃取，上層萃取液氮氣吹干后復溶。采用Accucore C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）分離，在正離子多反應監測模式下進行檢測。維生素A、維生素E的質量濃度分別在0.1～3、0.5～30 mg/L范圍內和相應色譜峰面積與同位素內標色譜峰面積之比的線性關系良好，相關系數均大于0.995。維生素A、維生素E的樣品加標回收率分別為87.2%～92.8%、98.6%～108.5%，測定結果的相對標準偏差均小于8%（n=6）。該方法適用于干血斑中維生素A和維生素E的同時測定。
關鍵詞： 干血斑； 維生素A； 維生素E； 超高效液相色譜-串聯質譜法
維生素是人體必需的微量營養素，參與調節體內各種代謝過程和生理活動，缺乏或過量都會引發相應的疾病[1?3]。其中，維生素A具有維持正常視力、促進生長發育、增加機體對傳染病的抵抗力等作用，缺乏時可引起夜盲癥、角膜干燥癥、皮膚干燥脫屑等疾病[4-5]；維生素E具有抗衰老、抗氧化、抗凝血、增強免疫力、改善血液循環、防止動脈硬化等作用[6]，長期缺乏可引起巨細胞性溶血性貧血、生殖機能障礙等疾病[7]。流行病學研究表明，維生素A、E缺乏或不足仍是一個重要的公共健康問題，尤其在兒童、孕婦、老年等特殊人群中[8]。通過精準檢測維生素濃度水平，并對危險因素進行干預，能顯著改善維生素缺乏或過量導致的危害，提升國民健康水平[9]。
目前維生素的檢測方法主要包括分光光度法、免疫層析法、高效液相色譜法和液相色譜串聯質譜法等[10-11]。液相色譜-串聯質譜法因具有靈敏度高、特異性好、多指標同時檢測等優勢，已成為維生素檢測的“金標準”[12-13]。干血斑采樣是利用濾紙采集血液樣本的技術[14]，相較于常規靜脈采血方法，干血斑具有采血量少、儲運簡便、生物安全性好等優勢，是一種適于兒童、孕婦、老年等特殊人群的微創采血方法[15-16]。為了更好地滿足臨床維生素檢測需求，筆者采用超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立同時測定干血斑中維生素A和維生素E的方法，并進行方法的驗證及應用研究。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
超高效液相色譜-串聯質譜儀：SCIEX QTRAP 5500型，美國SCIEX公司。
電子天平：ES225SM-DR型，感量為0.01 mg，上海天美天平儀器有限公司。
多管渦旋混合儀：MTV-100型，杭州奧盛儀器有限公司。
高速冷凍離心機：5427R型，艾本德（上海）國際貿易有限公司。
超聲波清洗機：SB-5200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司。
超純水機：UPH-IV-10TNP型，四川優普超純科技有限公司。
氮吹儀：BCN9602型，深圳逗點生物技術有限公司。
維生素A（視黃醇，VA）、維生素E（α-生育酚，VE）、[19,19,19,20,20,20-D6]視黃醇（視黃醇-d6）：質量分數分別為96.0%、98.3%、97.0%，批號分別為G0063895、G0089685、G0063135，曼哈格（上海）生物科技有限公司。
3,4-二氫-2,8-二甲基-5,7-二(三氘甲基)-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-6-色滿醇（α-生育酚-d6）：質量分數為98%，批號為MBBD0883，美國西格瑪奧德里奇公司。
人工全血基質：批號為23I002，北京匯智和源生物技術有限公司。
甲醇：質譜純，天津市康科德科技有限公司。
乙酸乙酯：質譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司。
甲酸：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 色譜儀
色譜柱：Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國賽默飛世爾科技公司）；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：A相為0.1%(體積分數)的甲酸-水溶液，B相為0.1%(體積分數)的甲酸-甲醇溶液，流量為0.4 mL/min；洗脫方式：線性梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution procedure
1.2.2 質譜條件儀
離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；數據采集模式：多反應監測掃描(MRM)；離子源溫度：500 ℃；離子化電壓：5 500 V；氣簾氣壓力：138 kPa；噴霧氣壓力：414 kPa；輔助加熱氣壓力：345 kPa；碰撞氣壓力：41 kPa。維生素A、維生素E及內標的質譜參數見表2。
表2 維生素A、維生素E及內標的質譜參數
Tab. 2 Mass spectral parameters of vitamin A, vitamin E and internal standard
1.3 實驗步驟
1.3.1 溶液配制
標準儲備溶液：精密稱取維生素A、視黃醇-d6、維生素E、α-生育酚-d6適量，分別置于容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，搖勻，得維生素A、視黃醇-d6標準儲備溶液的質量濃度為1 000 mg/L，維生素E、α-生育酚-d6標準儲備溶液的質量濃度為2 000 mg/L。
混合內標工作溶液：分別準確移取視黃醇-d6、α-生育酚-d6標準儲備溶液適量，用甲醇稀釋后混勻，配制成混合內標工作溶液（視黃醇-d6、α-生育酚-d6的質量濃度分別為10、20 mg/L）。
混合標準儲備溶液：分別準確移取維生素A、維生素E標準儲備溶液適量，用甲醇稀釋后混勻，配制成高濃度混合標準儲備溶液（維生素A、維生素E的質量濃度分別為60、600 mg/L）和低濃度混合標準儲備溶液（維生素A、維生素E的質量濃度分別為2、10 mg/L）。
系列混合標準工作溶液：分別準確移取高、低濃度混合標準儲備溶液適量，與人工全血基質混勻，配制成維生素A質量濃度分別為0.100 0、0.245 0、0.390 0、0.680 0、1.260、1.550、3.000 mg/L，維生素E質量濃度分別為0.500 0、1.975、3.450、6.400、12.30、15.25、30.00 mg/L的標準曲線樣品系列混合標準工作溶液。按相同方法，制得到維生素A質量濃度分別為0.240 0、0.600 0、1.200 mg/L，維生素E質量濃度分別為4.000、10.00、20.00 mg/L的質控樣品系列工作溶液。
1.3.2 標準曲線樣品、質控樣品和空白樣品制備
準確移取系列混合標準工作溶液75 μL，分別滴到濾紙片，晾干，得到干血斑標準曲線樣品及質控樣品。另取人工全血基質，按照相同方法制成干血斑空白樣品。
1.3.3 樣品處理
使用直徑為3 mm的打孔器，在干血斑樣品上取兩個干血點（相當于6 μL全血），置于2 mL離心管中，加入75 μL 純化水，超聲提取5 min，加入100 μL混合內標工作溶液，渦旋振蕩1 min，加入乙酸乙酯1 000 μL，渦旋振蕩10 min，以12 500 r/min的轉速離心15 min。吸取乙酸乙酯層900 μL，置于U型96孔板中，氮氣吹干，加入體積分數為70%的甲醇-水溶液100 μL復溶，渦旋振蕩5 min，以4 000 r/min的轉速離心5 min，取上清液測定。
1.3.4 樣品測定
取上述樣品溶液，在1.2儀器工作條件下測定，以色譜峰面積內標法定量。
2. 結果與討論
2.1 質譜參數優化
由于維生素A和維生素E結構中均存在芳香環、脂肪鏈和羥基結構，在正離子模式下電離較為穩定，因此采用正離子模式下進行檢測。從一級質譜掃描圖和二級碎裂質譜掃描圖可知，維生素A在ESI正離子模式下形成的[M+H]+準分子離子為m/z 269.3，主要碎片離子為m/z 231.9、m/z 93.0；維生素E的[M+H]+準分子離子為m/z 431.3，主要碎片離子為m/z 342.9、m/z 165.1。采用儀器優化程序對上述離子對的錐孔電壓和碰撞能量值進行優化，分別以信號更強的m/z 93.0和m/z 165.1作為定量離子，按相同碎裂模式選擇同位素內標的離子對，優化后的參數見表2。
2.2 色譜條件優化
基于維生素A和維生素E的疏水性，選擇C18反相色譜柱進行色譜分離。比較了Thermo Scientific Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）和Phenomenex Kinetex C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）對維生素A和維生素E的分離效果，結果顯示，Kinetex C18柱分離的維生素A色譜峰出現裂峰，峰形較差，而Accucore C18柱可以實現所有組分的分離且峰形良好，保留時間穩定，因此選擇Accucore C18柱作為色譜柱。
分別采用甲醇-水、乙腈-水作為流動相，比較添加甲酸（體積分數為0.1%）對目標化合物色譜峰形及分離效果的影響，結果表明，以甲醇-水作為流動相，并在兩相中分別添加體積分數為0.1%的甲酸，可增加分析物的響應強度，各組分分離效果良好，且峰形良好。
2.3 樣品處理條件優化
2.3.1 萃取溶劑的選擇
維生素A和維生素E均為脂溶性維生素，易溶于正己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯等多種有機溶劑。本實驗分別考察了乙酸乙酯、正己烷、乙酸乙酯-正己烷（體積比為1∶1）的萃取效果見圖1。由圖1可知，當乙酸乙酯作為萃取劑時，維生素A和維生素E的響應更強，提取效率更高，且化合物峰形較好，因此，選用乙酸乙酯作為萃取溶劑。
圖1 不同提取溶劑對維生素A及維生素E提取效果的影響
Fig. 1 Influence of different solvents on the extraction of vitamin A and vitamin E.
2.3.2 復溶液的選擇
分別采用體積分數為50%和70%的甲醇-水溶液作為復溶液，比較目標化合物的峰面積見圖2。由圖2可知，以體積分數為70%的甲醇-水溶液進行復溶時，目標化合物的響應更強，且色譜峰形較好，因此選擇體積分數為70%的甲醇-水溶液作為復溶液。
圖2 不同復溶液對維生素A及維生素E復溶效果的影響
Fig. 2 Influence of different solution on the reconstitution of vitamin A and vitamin E.
2.4 選擇性
按照1.3.3所述方法處理干血斑空白樣品、高濃度質控樣品、臨床干血斑送檢樣品，在1.2儀器工作條件下進行測定，在目標成分維生素A、維生素E及內標的保留時間處無雜質干擾，目標成分及內標之間亦無干擾。
2.5 殘留
按照1.3.3所述方法，分別對干血斑空白樣品、標準曲線最低（定量下限）和最高濃度樣品進行處理，在標準工作曲線最高濃度樣品之后測定空白樣品，用目標物的峰面積來評估殘留，攜帶污染測試結果見表3。由表3可知，標準曲線最高濃度樣品之后測定的空白樣品中，目標物的殘留量不超過定量下限的20%，且內標殘留量不超過5%，滿足分析方法要求[17]。
表3 攜帶污染測試結果
Tab. 3 Results of carry-over effect
2.6 線性關系與檢出限、定量限
在1.2儀器工作條件下，對標準曲線樣品系列混合標準工作溶液進行測定，以目標物的質量濃度為橫坐標（x），以對應的色譜峰面積與同位素內標色譜峰面積之比為縱坐標（y），進行線性回歸，繪制標準工作曲線。
以3倍信噪比對應的維生素A、維生素E質量濃度作為方法檢出限，以10倍信噪比對應的維生素A、維生素E質量濃度作為方法定量限。
維生素A、維生素E的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表4。
表4 維生素A、維生素E的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限
Tab. 4 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit, and quantification limit of vitamin A and vitamin E
由表4可知，維生素A、維生素E分別在質量濃度分別為0.1～3、0.5～30 mg/L范圍內與相應色譜峰面積比線性關系良好，相關系數均大于0.995，滿足分析方法要求［17］。
2.7 精密度和準確度
按照1.3.3所述方法，分別對標準曲線最低濃度樣品和低、中、高濃度質控樣品進行處理，每組6份，在1.2儀器工作條件下進行測定，計算方法精密度和準確度，其中精密度表示為測定值的變異系數，而準確度表示為測定值與標示值的百分比，試驗結果見表5。由表5可知，維生素A的準確度為95.0%～106.6%，維生素E的準確度為97.6%～108.6%，二者的精密度均不超過7.2%，滿足分析方法要求[17]。
表5 精密度和準確度試驗結果
Tab. 5 Results of precision and accuracy assessment
2.8 樣品加標回收試驗
選取3組臨床全血樣品，每組6份，分別加入低、中、高濃度的混合標準工作溶液，混勻后得加標樣品工作溶液，按1.3.2方法制備干血斑加標樣品，按1.3.3方法進行處理，然后在1.2儀器工作條件下測定；另取上述臨床全血樣品制成干血斑樣品，用于檢測本底值，試驗結果見表6。由表6可知，維生素A的加標回收率為87.2%～92.8%，維生素E的加標回收率為98.6%～108.5%，測定結果的相對標準偏差均不超過5.2%（n=6），滿足分析方法要求[17]。
表6 樣品加標回收試驗結果
Tab. 6 Recovery results of spiked samples
3. 結語
建立了液相色譜-串聯質譜法同時測定干血斑樣本中維生素A和維生素E含量，分別對質譜、色譜檢測條件以及前處理過程中的萃取液、復溶液等進行了優化，從而提高了檢測靈敏度。該方法能夠在5 min內完成維生素A、維生素E的定性、定量分析，測定樣本需求量少、操作簡單、檢測結果準確、快速，可實現大量臨床樣本的同時檢測，尤其對采血較為困難的嬰幼兒，可以實現少量血液樣本檢測多個項目，為臨床維生素的精準檢測提供了技術支持。
參考文獻：
1 李雪梅， 吳慧慧， 陳競， 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法同時快速檢測微量血清中6種脂溶性維生素 ［J］. 現代預防醫學， 2022， 49（7）：1 297.
LI Xuemei， WU Huihui， CHEN Jing， et al. An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for simultaneous and rapid detection of six fat-soluble vitamins in small volumes of serum ［J］. Modern Preventive Medicine， 2022， 49（7）：1 297.
2 劉海培， 姜小梅， 韓文念， 等. 人體血清中3種脂溶性維生素的液相色譜-串聯質譜分析方法研究 ［J］. 分析測試學報， 2019， 38（6）：728.
LIU Haipei， JIANG Xiaomei， HAN Wennian， et al. Study on analysis methods of three fat-soluble vitamins in human serum liquid chromatography-tandem mass spectrometry ［J］. Journal of Instrumental Analysis， 2019， 38（6）：728.
3 李強， 金玉娥， 汪國權. 超高效液相色譜-串聯質譜法測定干血點中25-羥基維生素D ［J］.現代預防醫學， 2017， 44（11）：2 050.
LI Qiang， JIN Yue， WANG Guoquan， et al. Detection of 25-hydroxyvitamin D in dried blood spot by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Modern Preventive Medicine， 2017， 44（11）：2 050.
4 孟小征， 李幽然， 翟燕紅， 等. 人血清中維生素A/E高效液相色譜法與液相色譜-串聯質譜法的比對 ［J］. 標記免疫分析與臨床， 2022， 29（9）：1 579.
MENG Xiaozheng， LI Youran， ZHAI Yanhong， et al. A comparison between high performance liquid chromatography and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for vitamin A/E in human serum ［J］. Labeled Immunoassays and Clinical Medicine， 2022， 29（9）：1 579.
5 莫日根， 辛慧， 張曉東， 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法測定蛋白胨中6種脂溶性維生素 ［J］. 食品安全質量檢測學報， 2020， 11（20）：7 436.
MO Rigen， XIN Hui， ZHANG Xiaodong， et al. Determine of 6 kinds of fat-soluble vitamins in peptone using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ［J］. Journal of Food Safety & Quality， 2020， 11（20）：7 436.
6 ZHA L， LAW T， MACDONALD C， et al. Consolidation of vitamin A and E methods onto a multiplexing liquid chromato-graphy tandem mass spectrometry platform simplifies laboratory workflow ［J］. Clinica Chimica Acta， 2020， 505（3）：31.
7 陳曦， 宮照龍， 沈葹. 超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法測定血清中維生素A和維生素E［J］.衛生研究，2021，50（2）：301.
CHEN Xi， GONG Xiaolong， SHEN Shi， et al. Determine vitamin A and vitamin E in human serum by ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectro-metry［J］. Journal of Hygiene Research， 2021， 50（2）：301.
8 趙麗云，丁鋼強，趙文華，等. 2015—2017年中國居民營養與健康狀況監測報告 ［M］. 北京： 人民衛生出版社， 2022， 317.
ZHAO Liyun， DING Gangqiang， ZHAO Wenhua， et al. 2015—2017 nutrition and health monitoring report of chinese residents ［M］. Beijing：People's Medical Publishing House， 2022， 317.
9 中國營養學會健康管理分會. 維生素A營養狀況評價及改善專家共識 ［J］. 中華健康管理學雜志. 2023， 17（3）：180.
Health Management Branch of Chinese Nutrition Society. Expert consensus on the evaluation and improvement of vitamin A nutritional status ［J］. Chinese Journal of Health Management. 2023， 17（3）：180.
10 ALBAHRANI A A， ROTAROU V， ROCHE J P， et al. A simultaneous quantitative method for vitamins A， D and E in human serum using liquid chromatography-tandem mass spectrometry ［J］. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology， 2016， 159：41.
11 王睿， 付志成， 胡貽椿， 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定血清中維生素A、維生素E ［J］. 中國食物與營養， 2020， 26（9）：40.
WANG Rui， FU Zhicheng， HU Yichun， et al. Simultaneous determination on vitamin A and vitamin E in serum by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method ［J］. Food and Nutrition in China， 2020， 26（9）：40.
12 HUO Yumei， ZHANG Shangqing， WU Gaoping， et al. Rapid simultaneous determination of 7 fat-soluble vitamins in human serum by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ［J］. Analytical methods：advancing methods and applications， 2023，15（41）：5 535.
13 MA Yichen， YU Songlin， MU Danni， et al. Liquid chromato-graphy-tandem mass spectrometry in fat-soluble vitamin deficiency［J］. Clinica Chimica Acta， 2023， 548（1）：117 469.
14 宮竹君， 陳荷芬， 袁擁華， 等.干血斑法概述及其在器官移植免疫抑制藥治療藥物監測中的研究進展 ［J］.藥物分析雜志， 2023， 43（8）：1 277.
GONG Zhujun， CHEN Hefen， YUAN Yonghua， et al. Overview of the dried blood spot method and its application in therapeutic drug monitoring of immunosuppressants in organ transplantation ［J］. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis， 2023， 43（8）：1 277.
15 CHHONKER Y S， AHMED N， JOHNSTON CHRISTINE M， et al. A Simultaneous extraction/derivatization strategy for quantitation of vitamin D in dried blood spots using LC-MS/MS：application to biomarker study in subjects tested for SARS-CoV-2［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2023， 24 （6）：5 489.
16 WANG Haibo， XIAO Xuan， DAI Wen， et al. Rapid LC-MS/MS detection of 25-hydroxyvitamin D in dried blood spots ［J］. Analytica Chimica Acta， 2023， 1283（1）：341 964.
17 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（2020年版）四部［M］. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020：466.
NATIONAL PHARMACOPOEIA COMMISSION. Pharmaco-poeia of the people's republic of China （2020 edition， part four） ［M］. Beijing：China Medical Technology Press， 2020：466.
引用本文： 權帆，詹珍旋，趙寧，等 . 超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定干血斑中維生素A和維生素E［J］. 化學分析計量，2024，33（12）：17. (QUAN Fan, ZHAN Zhenxuan, ZHAO Ning, et al. Simultaneous determination of vitamin A and vitamin E in dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 17.)
來源：化學分析計量
