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一、蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成的多肽鏈經(jīng)過盤曲折疊形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。

蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進(jìn)行代謝與更新。

蛋白質(zhì)是由C（碳）、H（氫）、O（氧）、N（氮）組成，一般蛋白質(zhì)可能還會(huì)含有P（磷）、S（硫）、Fe（鐵）、Zn（鋅）、Cu（銅）、B（硼）、Mn(錳)、I（碘）、Mo（鉬）等。

這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳50% 氫7% 氧23% 氮16% 硫0~3% 其他微量。

（1）一切蛋白質(zhì)都含N元素，且各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%；

（2）蛋白質(zhì)系數(shù)：任何生物樣品中每1g元N的存在，就表示大約有100/16=6.25g蛋白質(zhì)的存在， 6.25常稱為蛋白質(zhì)常數(shù)

二、檢測(cè)方法

食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法主要有凱氏定氮法,雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）

1.凱氏定氮法【GB/T 5009.5—1985】

實(shí)驗(yàn)原理
蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

2.雙縮脲法（biuret法）

實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。

3.folin―酚試劑法（lowry法）

實(shí)驗(yàn)原理

這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin―酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。

4.考馬斯亮蘭法（bradford法）

實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲法（biuret法）和folin—酚試劑法（lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測(cè)定的方法。

1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。

考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。

在595nm下測(cè)定的吸光度值a595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：

（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比lowry法要大的多。

（2）測(cè)定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

（3）干擾物質(zhì)少。如干擾lowry法的k+、Na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不干擾此測(cè)定法。

此法的缺點(diǎn)是：

（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、triton x-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和0.1n的NaOH。（如同0.1n的酸干擾lowary法一樣）。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。

6.紫外吸收法

實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。

此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。

此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。

三、國家標(biāo)準(zhǔn)

1 GB/T 24897-2010 糧油檢驗(yàn) 稻谷粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定 近紅外法

2 GB/T 24899-2010 糧油檢驗(yàn) 小麥粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定 近紅外法
3 GB/T 24901-2010 糧油檢驗(yàn) 玉米粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定 近紅外法
4 GB/T 24870-2010 糧油檢驗(yàn) 大豆粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量的測(cè)定 近紅外法
5 GB/T 24871-2010 糧油檢驗(yàn) 小麥粉粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定 近紅外法
6 GB 24788-2009 醫(yī)用手套表面殘余粉末、水抽提蛋白質(zhì)限量
7 GB/T 24318-2009 杜馬斯燃燒法測(cè)定飼料原料中總氮含量及粗蛋白質(zhì)的計(jì)算
8 GB/T 2910.4-2009 紡織品 定量化學(xué)分析 第4部分：某些蛋白質(zhì)纖維與某些其他纖維的混合物(次氯酸鹽法)
9 GB/T 14489.2-2008 糧油檢驗(yàn) 植物油料粗蛋白質(zhì)的測(cè)定
10 GB/T 5511-2008 谷物和豆類 氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算 凱氏法
11 GB/T 21870-2008 天然膠乳醫(yī)用手套水抽提蛋白質(zhì)的測(cè)定 改進(jìn)Lowry法
12 GB/T 17811-2008 動(dòng)物性蛋白質(zhì)飼料胃蛋白酶消化率的測(cè)定 過濾法
13 GB/T 19495.8-2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 蛋白質(zhì)檢測(cè)方法
14 GB/T 18868-2002 飼料中水分、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、賴氨酸、蛋氨酸快速測(cè)定 近紅外光譜法