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這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

（1）簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

（2）精確計(jì)算
通過(guò)計(jì)算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過(guò)如下公式計(jì)算最終結(jié)果：
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度
D為溶液的稀釋倍數(shù)

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

1. 學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。

2. 掌握紫外分光光度計(jì)的操作方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

紫外吸收法可測(cè)定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡(jiǎn)便，測(cè)定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類(lèi)不干擾測(cè)定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用。

【實(shí)驗(yàn)材料】

1. 實(shí)驗(yàn)器材

試管及試管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度計(jì)。

2. 實(shí)驗(yàn)試劑

(1) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確配制2mg/ml的酪蛋白溶液。

(2) 樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

取7支試管按下列各表加入各試劑：

試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計(jì)上，于280nm處以0號(hào)管為對(duì)照，分別測(cè)定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2. 測(cè)定未知樣品

取樣品溶液4毫升,加蒸餾水4ml混勻，在280nm下測(cè)定其光密度值。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量。

比色法蛋白濃度測(cè)定蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

實(shí)驗(yàn)原理

　雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩 個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

試劑與器材

試劑：

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱(chēng)量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。

（2）雙縮脲試劑：稱(chēng)以1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

器材：

1. 可見(jiàn)光分光光度計(jì)) q A4 S8 X9 t, n

2. 比色杯

3. 大試管15支

4. 旋渦混合器等。

操作方法

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20~25℃）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2. 樣品的測(cè)定：取2~3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

掌握用BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法

【實(shí)驗(yàn)原理】

BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。

蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。

【實(shí)驗(yàn)材料】

1.實(shí)驗(yàn)器材

721分光光度計(jì)；恒溫水浴槽；移液管；微量進(jìn)樣器；試管架和試管。

2.實(shí)驗(yàn)試劑

(1) BCA試劑的配制

① 試劑A，1L：分別稱(chēng)取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。

② 試劑B，50ml：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸餾水至50ml。

③ BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。

(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱(chēng)取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

(3)樣品溶液：配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

取6支干燥潔凈的大試管，編號(hào)，按下表加入試劑。

上述試劑加完后，混勻，于37℃保溫30min，冷卻至室溫后，以第1管為對(duì)照，在562nm處比色，讀取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.樣品測(cè)定

準(zhǔn)確吸取250μl樣品溶液于一干燥潔凈的試管中，加入BCA試劑5ml，搖勻，于37℃保溫30min，冷卻至室溫后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)1號(hào)管為對(duì)照，在595nm處比色，記錄吸光值。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。

【目的】 掌握Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理。
【原理】 蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線(xiàn)性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。
【操作】取試管7支、編號(hào)、按下表操作：

立即混勻，在20℃～25℃水浴保溫30分鐘。用660nm比色，測(cè)定光密度值。
操作注意事項(xiàng)：
1. 按順序添加試劑
2. 試劑乙在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下（試劑甲）易被破壞，因此加試劑乙后要立即混勻，加一管混勻一管，使試劑乙（磷目酸）在破壞前即被還原。
【計(jì)算】
(一)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
(二)以測(cè)定管光密度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g／L)。
(三)再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇—管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g／L)。
【器材】

(一)721型分光光度計(jì)
(二)恒溫水浴箱
(三)中試管7支
(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。
【試劑】

(一)試劑甲
(1)4％碳酸鈉(Na2CO3)溶液
(2)0.2N氫氧化鈉溶液
(3)1％硫酸銅溶液(CuSO4·5H2O)
(4)2％酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀或鈉)
在使用前(1)與(2)、(3)與(4)等體積混合，再將兩混合液按50：1比例混合，即為試劑甲。該試劑只能用一天，過(guò)期失效。
(二)試劑乙：
(1)市售酚試劑在使用前用NaOH滴定，以酚肽為指標(biāo)劑，根據(jù)試劑酸度將其稀釋?zhuān)棺詈笏岫葹?N。
(2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。溶于蒸餾水700ml中，再加85％ H3PO4 50ml和HCl(濃)100ml，將上物混合后，置1000ml圓底燒瓶中溫和地回流十小時(shí)，再加硫酸鋰(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水?dāng)?shù)滴。繼續(xù)沸騰15分鐘后以除去剩余的溴，冷卻后稀釋至1000ml然后過(guò)濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色(如帶綠色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，以酚酞為指示劑，而后稀釋約一倍，使最后酸度為1N。
(三)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液
用結(jié)晶牛血清白蛋白，根據(jù)其純度用蒸餾水配制成0.25mg／ml的蛋白質(zhì)溶液。(純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定)。
(四)待測(cè)樣品：準(zhǔn)確取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混勻，也可以用尿液為樣品。

【目的要求】

學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

考馬斯亮藍(lán)G―250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer’s law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。

蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過(guò)程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，在測(cè)定溶液中含蛋白質(zhì)5µL/ml時(shí)就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測(cè)定范圍為10-100µg蛋白質(zhì)，微量測(cè)定法測(cè)定范圍是1－10µg蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好，精確度高，線(xiàn)性關(guān)系好。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線(xiàn)彎曲程度很輕，不影響測(cè)定。

此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無(wú)干擾。強(qiáng)堿緩沖液在測(cè)定中有一些顏色干擾，這可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照扣除其影響。Tris，乙酸，2―巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如Triton X―100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對(duì)顏色影響太大而不易消除。

試劑與器材

1、試劑

考馬斯亮藍(lán)試劑：

考馬斯亮藍(lán)G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G―250，4.7%(W/V)乙醇。

2、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液

① 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。

② 未知蛋白質(zhì)溶液。

3、器材

試管及試管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度計(jì)。

【操作方法】

1、標(biāo)準(zhǔn)法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

取14支試管，分兩組按下表a平行操作。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2、微量法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

取12支試管，分兩組按下表b平行操作。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

3、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。

注意事項(xiàng)

① 如果測(cè)定要求很?chē)?yán)格，可以在試劑加入后的5－20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。

② 測(cè)定中，蛋白－染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

學(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。

【實(shí)驗(yàn)原理】

凱氏定氮法用于測(cè)定有機(jī)物的含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過(guò)程通常稱(chēng)為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。

消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止。根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。

蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測(cè)出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。

【實(shí)驗(yàn)材料】

1.實(shí)驗(yàn)器材

微量凱氏定氮儀 1套；50ml凱氏燒瓶 4個(gè)；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠

2.試驗(yàn)試劑

(1) 濃硫酸；30％氫氧化鈉溶液；2％硼酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(0.01mol／L)。

(2) 粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物 ：K2SO4與CuSO4·5H2O以3：1配比研磨混合。

(3)混合指示劑(田氏指示劑)：由50ml 0.1％甲烯藍(lán)乙醇溶液與200ml 0.1％甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。

(4) 樣品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1.安裝凱氏定氮儀。

2.消化：取4個(gè)50ml凱氏燒瓶并標(biāo)號(hào),各加1顆玻璃珠，在1號(hào)及2號(hào)瓶中各加樣品1ml，催化劑(K2SO4- CuSO4· 5H2O)200 mg，濃硫酸5 ml。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號(hào)及4號(hào)瓶中各加1 ml蒸餾水和與1、2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照。在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行消化。

在消化開(kāi)始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開(kāi)始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫。

3.蒸餾：

(1)蒸餾器的洗滌：用水洗滌干凈微量凱氏定氮儀，在蒸汽發(fā)生器中加入用幾滴硫酸酸化的蒸餾水和幾滴甲基紅指示劑，用這樣的水蒸氣洗滌凱氏定氮儀。約15分鐘后，在冷凝器下端傾斜放好裝有硼酸-指示劑的錐形瓶，繼續(xù)蒸汽洗滌2分鐘，觀察錐形瓶?jī)?nèi)的溶液是否變色，如不變色則證明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。移走錐形瓶，停止加熱，打開(kāi)夾子。

(2)蒸餾：取下棒狀玻塞，用吸管吸取消化液，細(xì)心地插到反應(yīng)室小玻璃杯的下方，塞緊棒狀玻塞。將一個(gè)含有硼酸和指示劑的錐形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸沒(méi)在液體內(nèi)。取30％的氫氧化鈉溶液10ml放入小玻璃杯中，輕提棒狀玻璃塞使之流入反應(yīng)室(為了防止冷凝管倒吸，液體流入反應(yīng)室必須緩慢)。尚未完全流入時(shí)，將玻璃塞蓋緊，向玻璃杯中加入蒸餾水約5ml。再輕提玻璃塞，使一半蒸餾水慢慢流入反應(yīng)室，一半留在玻璃杯中作水封。加熱水蒸汽發(fā)生器，沸騰后夾緊夾子，開(kāi)始蒸餾。氨氣進(jìn)入錐形瓶，瓶中的酸溶液由紫色變成綠色。變色時(shí)起記時(shí)，再蒸餾5分鐘。移動(dòng)錐形瓶，使硼酸液面離開(kāi)冷凝管約1 厘米，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外面，繼續(xù)蒸餾1分鐘，移開(kāi)錐形瓶，用表面皿覆蓋錐形瓶。蒸餾完畢后，須將反應(yīng)室洗滌干凈，再繼續(xù)下一個(gè)蒸餾操作。待樣品和對(duì)照均蒸餾完畢后，同時(shí)進(jìn)行滴定。

4.滴定：用0.01mol／L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠色變淡紫色為滴定終點(diǎn)。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

運(yùn)算下列公式計(jì)算出每次無(wú)機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品的總含氮量。

式中 WN——每毫升樣品的含氮毫克數(shù)；

A——滴定樣品消耗的鹽酸量（mL）；

B——滴定空白消耗的鹽酸量（mL）；

C——測(cè)定樣品所取用量（mL）；

0.0100——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸物質(zhì)的量濃度（mol/L）；

14.008——每摩爾氮原子質(zhì)量（g/mol）。

三次樣品測(cè)定的含氮量相對(duì)誤差應(yīng)小于±2%。

樣品粗蛋白含量＝總氮量× 6.25

6.25為含氮量換算為蛋白質(zhì)含量的系數(shù)。.這個(gè)系數(shù)來(lái)自蛋白質(zhì)平均含氮量為16％，實(shí)際上各種蛋白質(zhì)因氨基酸組成不同，含氮量不完全相同。

組成 包裝（1000微孔) 保存
Folin酚甲試劑A 100ml×2 2-8℃
Folin酚甲試劑B 5ml 2-8℃
Folin酚乙試劑(1N) 20ml 2-8℃ PBS稀釋液 30ml 2-8℃
BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn) (5mg/ml BSA) 1ml -20℃

本試劑盒自訂購(gòu)之日起一年內(nèi)有效。
Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將Folin試劑還原，產(chǎn)生深藍(lán)色，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。定量范圍為5～100μg/ml蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類(lèi)、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。

操作說(shuō)明：
一 .酶標(biāo)儀法
1. 根據(jù)需要量，將Folin酚甲試劑A和Folin酚甲試劑B按50：1混合，其有效期為24小時(shí)，過(guò)期失效。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10微升BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100微升（標(biāo)準(zhǔn)品一般可用PBS稀釋?zhuān)菇K濃度為0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足到20微升。
3. 將樣品作適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄗ詈枚嘧鰩讉€(gè)梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋?zhuān)?0微升到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時(shí)的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)1/2后。
4. 將配好的Folin酚甲試劑每孔加入200微升，輕輕震動(dòng)，混勻，室溫放置10分鐘。
5. 各孔加入20微升Folin酚乙試劑，迅速混勻，37℃放置30分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定A650，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲
線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。
6. 使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水粉蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。

注：如沒(méi)有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)，將所加試劑都等比放大，在離心管中混勻后加入比色皿中比色。

二 .分光光度計(jì)法
如沒(méi)有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。步驟如下：
1. 根據(jù)需要量，將Folin酚甲試劑A和Folin酚甲試劑B按50：1混合，其有效期為24小時(shí)，過(guò)期失效。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10微升BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100微升（標(biāo)準(zhǔn)品一般可用PBS稀釋?zhuān)菇K濃度為0.5mg/ml。
3. 取八支（或者更多）5ml離心管，標(biāo)讓號(hào)，按下表加入試劑。

4．混勻，37℃放置30分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定A650。

組成 包裝（500微孔) 保存
BCA試劑 100ml 2-8℃
Cu試劑 3ml 2-8℃
PBS稀釋液 30ml 2-8℃
BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn) (5mg/ml BSA) 1ml -20℃

本試劑盒自訂購(gòu)之日起一年內(nèi)有效。

堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。常用濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但受螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類(lèi)的影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

操作說(shuō)明：
一 . 微孔酶標(biāo)儀法
1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10微升BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100微升(樣品一般可用PBS稀釋)，使終濃度為0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足到20微升。
3. 將樣品作適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄗ詈枚嘧鰩讉€(gè)梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋?zhuān)?0微升到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時(shí)的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)1/2后。
4. 各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置15-30分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定A562nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。
二 . 分光光度計(jì)法
如沒(méi)有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。
步驟如下：
1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取100微升BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至1ml(樣品一般可用PBS稀釋)，使終濃度為0.5mg/ml。
3. 取八支（或者更多）5ml離心管，標(biāo)讓號(hào)，按下表加入試劑。

4. 37℃放置15-30分鐘。用分光光度計(jì)測(cè)562nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。

組成 包裝（2500微孔) 保存
5×G250染色液 100ml 2-8℃
PBS稀釋液 30ml 2-8℃
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/ml BSA) 1ml -20℃

本試劑盒自訂購(gòu)之日起九個(gè)月內(nèi)有效。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，在一定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。樣品中巰基乙醇的濃度可高達(dá)1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá)5mM。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用索萊寶生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

【操作說(shuō)明】
一.微孔酶標(biāo)儀法
1. 完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10ml，稀釋至250ml ，使終濃度為0.2mg/ml。待測(cè)蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
2. 5×G250染色液使用前請(qǐng)顛倒3-5次混勻，取1ml 5×G250染色液，加入4ml雙蒸水，混勻成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。
3. 將標(biāo)準(zhǔn)品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分別加到96孔板中，加PBS稀釋液補(bǔ)足到20微升。
4. 將樣品作適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄗ詈枚嘧鰩讉€(gè)梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋?zhuān)?0微升到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時(shí)的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)1/2后。
5. 各孔加入200微升稀釋后的1×G250染色液，室溫放置3-5分鐘。
6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定A595，或560-610nm之間的其它波長(zhǎng)的吸光度。
7. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

二.分光光度計(jì)法
如沒(méi)有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。
步驟如下：
1. 取八支（或者更多）干凈的10ml離心管，標(biāo)記上號(hào)。

2. 取100ulBSA，加PBS 2.4ml稀釋至終濃度為0.2mg/ml。
3. 5×G250染色液使用前請(qǐng)顛倒3-5次混勻，取10ml 5×G250染色液，加入40ml雙蒸水，混勻成 1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。
4. 按下表加入試劑(以每孔5ml計(jì)，多余的用來(lái)清洗比色皿)

5. 反應(yīng)3分鐘后測(cè)OD值。為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，可每間隔2分鐘加一管染色液，每間隔2分鐘測(cè)一管OD值。如下表

此圖為伯樂(lè)酶標(biāo)儀680，單波長(zhǎng)，570nm測(cè)得。室溫反應(yīng)三分鐘。