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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-03-13 08:54
在蛋白質(zhì)組學(xué)及分子生物學(xué)研究中，凝膠電泳技術(shù)（如SDS-PAGE電泳）因其高分辨率分離能力，已成為解析復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物、評估分子量分布及翻譯后修飾的核心技術(shù)。
凝膠電泳后的染色步驟是實驗中至關(guān)重要的一環(huán)，通過與蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合，使電泳分離后的蛋白質(zhì)條帶得以顯現(xiàn)出來，為后續(xù)的定性、定量分析以及質(zhì)譜鑒定奠定基礎(chǔ)。染色方法有很多種，下面為你介紹實驗室常用的幾種染色方法。
圖片來源：https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/biomolecules/x04f6bc56:protein-analysis-techniques/a/protein-electrophoresis-and-sds-page
一、考馬斯亮藍(lán)染色（Coomassie Brilliant Blue, CBB）
考馬斯亮藍(lán)染色是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)染色方法，適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后的蛋白質(zhì)檢測。考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）是一種酸性三苯甲烷染料，通過靜電作用與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)（如氨基、胍基）結(jié)合，同時通過疏水作用與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域相互作用，形成藍(lán)色復(fù)合物。
這種復(fù)合物在可見光下呈現(xiàn)深藍(lán)色條帶，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的可視化檢測。這種方法靈敏度較高，可以檢測到約0.1μg的蛋白質(zhì)，且背景染色低，易于操作。
圖片來源：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056168.g001
目前廣泛用的考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種，G-250含三個磺酸基團(tuán)和兩個甲基，在酸性溶液中呈藍(lán)偏綠色，與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合，形成深藍(lán)色復(fù)合物，但脫色困難；R-250比G-250少兩個甲基且磺酸基團(tuán)較少，呈藍(lán)色帶紅色調(diào)，通過靜電和疏水雙重作用緩慢結(jié)合，染色后可通過有機(jī)溶劑洗脫，操作成本低但耗時較長。G-250質(zhì)譜兼容性更優(yōu)，而R-250適合常規(guī)染色及長期保存。
二、 銀染（Silver Staining）
銀染法是一種基于金屬銀沉積顯色的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，靈敏度可達(dá)0.1-1 ng/條帶，比考馬斯亮藍(lán)染色高100-1000倍。
銀染法的顯色過程分為兩個關(guān)鍵階段：
1、銀離子結(jié)合：
銀離子（Ag?）通過靜電作用與蛋白質(zhì)的羧基（-COOH）、氨基（-NH?）及硫醇基（-SH）結(jié)合，形成"蛋白質(zhì)-銀"復(fù)合物。
2、銀離子還原：
在還原劑（如甲醛、硼氫化鈉或硫代硫酸鈉）的作用下，銀離子（Ag?）被還原為金屬銀（Ag?），金屬銀在蛋白質(zhì)表面沉積，形成可見的黑色或棕色條帶，顯色強度與蛋白含量正相關(guān)。
雖然銀染法的靈敏度遠(yuǎn)高于考馬斯亮藍(lán)染色，但其操作步驟較為復(fù)雜，且甲醛的使用讓凝膠中蛋白化學(xué)交聯(lián)，導(dǎo)致質(zhì)譜不兼容；線性范圍窄，不太適合量化；核酸、脂類、糖脂類化合物常會對銀染染色的結(jié)果進(jìn)行干擾，導(dǎo)致實驗重復(fù)率低。
圖片來源：https://www.licorbio.com/applications/colorimetric-and-fluorescent-gel-staining
三、負(fù)染（Negative Staining）
負(fù)染法是一種通過選擇性沉淀金屬離子于凝膠背景，使蛋白質(zhì)條帶保持透明的快速檢測技術(shù)。其核心是反向顯影（背景染色，蛋白透明），負(fù)染液中的金屬離子（如鋅、銅、鎳等）在凝膠的非蛋白區(qū)域（聚丙烯酰胺基質(zhì)）形成不溶性鹽沉淀，產(chǎn)生深色背景。蛋白質(zhì)條帶因表面電荷或化學(xué)特性阻礙金屬鹽沉積，保持透明或淺色，與深色背景形成對比。
常用方法包括咪唑鋅法和氯化銅法，以咪唑鋅為例，鋅離子通過配位作用與咪唑結(jié)合，形成復(fù)合物沉淀于凝膠基質(zhì)；蛋白質(zhì)條帶因缺少結(jié)合位點保持透明。染色后可通過EDTA或磷酸緩沖液洗脫金屬離子，恢復(fù)蛋白質(zhì)活性。
圖片來源：https://www.nacalai.com/global/Download/pdf/Gel_Negative_Stain_Kit.pdf
負(fù)染法的優(yōu)點是快速、低成本、不破壞蛋白質(zhì)活性；缺點是對比度較差，且重現(xiàn)性受到諸多物理化學(xué)因素的影響(例如染色液的pH，膠中陰離子的濃度、溫度等)，因此限制本方法的廣泛使用。
四、熒光染色（Fluorescent Staining）
熒光染色是一種基于熒光染料特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測技術(shù)，該方法靈敏度可達(dá)納克級（如SYPRO Ruby靈敏度可達(dá)1-10 ng/條帶）。其核心原理是通過熒光分子與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在特定波長光激發(fā)下發(fā)射熒光信號，從而實現(xiàn)可視化檢測。
圖片來源：https://www.researchgate.net/publication/323999097_Fluorogenic_Ag-Tetrazolate_Aggregation_Enables_Novel_and_Efficient_Fluorescent_Biological_Silver_Staining
常見的熒光染料如SYPRO Ruby和Deep Purple，它們與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式可能不同，有的是通過疏水相互作用，有的可能涉及靜電作用或其他機(jī)制。
● 疏水作用主導(dǎo)型（如SYPRO Ruby、Deep Purple）：染料通過疏水作用嵌入SDS包裹的蛋白質(zhì)疏水區(qū)域，而非依賴靜電結(jié)合。這種結(jié)合方式無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行共價修飾，因此不會干擾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。
● 靜電作用主導(dǎo)型（如Nile Red、Epicocconone）：在非變性電泳中，染料通過靜電作用結(jié)合蛋白質(zhì)表面帶電基團(tuán)（如氨基、羧基）適用于Native-PAGE或特定修飾蛋白檢測。
● 共價結(jié)合型（如FITC、Cy系列染料）：通過化學(xué)反應(yīng)（如與氨基共價結(jié)合）標(biāo)記蛋白質(zhì)，與疏水或靜電作用型染料不同，共價結(jié)合型染料需要在電泳前，即蛋白質(zhì)樣品制備階段，就與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。
以上就是蛋白質(zhì)凝膠常見的幾種染色方法，在實際應(yīng)用中，我們需要根據(jù)實驗?zāi)康摹⒌鞍踪|(zhì)豐度、后續(xù)分析需求以及實驗條件等因素，綜合考慮各種染色方法的優(yōu)缺點，選擇最合適的染色方案，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
來源：實驗老司機(jī)梨醬
