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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-03-19 08:52
《中華人民共和國藥典》（2020 年版）（簡稱“《中國藥典》”）收載了9251 細菌內(nèi)毒素檢查法應用指導原則。同年，《美國藥典》（47 版）（簡稱“《美國藥典》”）也收載了1085 細菌內(nèi)毒素檢查法應用指導原則。表明細菌內(nèi)毒素檢查法在世界范圍內(nèi)經(jīng)過多年發(fā)展，為了應對新的情況，均需要進行新的官方解讀和指導。中、美兩國藥典中的內(nèi)毒素檢查法指導原則具有多項不同，本文參考《美國藥典》1085 細菌內(nèi)毒素檢查法應用指導原則和《中國藥典》9251 細菌內(nèi)毒素檢查法應用指導原則，對中美內(nèi)毒素標準物質(zhì)管理、質(zhì)量管理的異同，指導原則中易誤讀的要點解讀等相關(guān)內(nèi)容進行概括，為內(nèi)毒素檢測從業(yè)者提供參考。
凝膠法（Gel-clot technique）SOP示例
1 適用范圍
依據(jù)USP <85>, Ph. Eur. 2.6.14, Ch.P<1143> 和JP XVII Chapter 4.01制定的細菌內(nèi)毒素的檢測方法。該方法可支持產(chǎn)品開發(fā)的各個階段。
2 樣品要求
每種樣品至少準備 1 瓶。
1)常規(guī)批次放行檢測時，分別對每批起始、中間和末尾的 1 瓶樣品進行單獨檢測。
2)穩(wěn)定性檢測時，每個穩(wěn)定性時間點檢測 1 瓶樣品，不得混合多個樣品瓶。
3 安全注意事項
始終遵循安全的實驗室操作規(guī)范。若不熟悉特定化學品的安全預防措施，處理前需查閱相應的安全數(shù)據(jù)表（SDS）。
4 儀器與設(shè)備
1)微孔板（96 孔）
2)去熱原或無熱原稀釋管
3)用于對玻璃器皿進行去熱原處理的熱空氣烘箱或馬弗爐（250°C）
4)無熱原血清移液管
5)無熱原艾本德移液器及吸頭
6)渦旋混合器
7)石蠟膜
8)校準定時器
9)酶標儀（Bio - Tek® 型號 ELx - 808，BioTek 儀器公司生產(chǎn)）
10)內(nèi)毒素分析軟件，Endoscan V
5 溶劑 / 試劑 / 化學品
1)控制標準內(nèi)毒素（CSE）
2)Endochrome - K 裂解物試劑（Charles River 公司生產(chǎn)）
3)LAL 試劑水（LRW）
6 溶液制備
注：EU（內(nèi)毒素單位）和 IU（國際單位）為等效單位。
6.1 LAL 試劑水（LRW）
使用經(jīng)認證的 LRW 稀釋標準品，并制備陽性對照。
A.標準曲線制備
1)按照標準內(nèi)毒素的復溶和儲存說明進行操作。CSE 的效價與其配套的裂解物相關(guān)。根據(jù)供應商的分析證書，確認特定 CSE - 裂解物組合的正確復溶體積。
2)查閱 CSE 產(chǎn)品說明書，獲取穩(wěn)定性信息和產(chǎn)品限制條件。
3)按廠家說明復溶標準品，渦旋 5 分鐘。用無熱原水制備標準曲線稀釋液，操作如下（每次稀釋前渦旋 1 分鐘，再進行后續(xù)稀釋）：
復溶后的內(nèi)毒素 = 50 EU/mL
0.5 mL（50 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 5.0 EU/mL
0.5 mL（5 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.5 EU/mL
0.5 mL（0.5 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.05 EU/mL
0.5 mL（0.05 EU/mL）+ 4.5 mL 水 = 0.005 EU/mL
每個標準溶液（5.0 - 0.005 EU/mL）均需在兩個孔中進行檢測。
B.樣品制備說明
1)用 1 mL LRW 復溶樣品（5 mg/mL）。
2)1:50 稀釋：取 0.1 mL 樣品加入去熱原容器，再加入 4.9 mL LRW，充分渦旋混勻。最終稀釋液在兩個孔中進行檢測。將數(shù)據(jù)輸入Endoscan - V 軟件時，孔位布局讀數(shù)為0.1000，結(jié)果以 EU/mg 表示。
C.對照設(shè)置
1)陽性產(chǎn)品對照（PPC）：為每個樣品制備 PPC，直接在檢測板上向 100 µL 樣品中加入 10 µL 濃度為 5.0 EU/mL 的標準品（由 CSE 制備），加入的內(nèi)毒素常稱為 “加標”。檢測板上的名義濃度為 0.5 EU/mL。
2)陰性對照（NC）：使用 LRW 作為陰性對照（見下文 7 檢測步驟部分），陰性對照需在兩個孔中進行檢測。
6.2（Endochrome K）裂解物試劑
小心取下小瓶瓶塞，向凍干的裂解物小瓶中加入 3.2 mL LRW。重新塞上瓶塞，輕輕顛倒混勻數(shù)次，請勿渦旋。若樣品數(shù)量足夠，需要使用多個小瓶時，將各小瓶內(nèi)容物混合。復溶后的裂解物可在 2 - 8°C 儲存，最長不超過 24 小時。
7 檢測步驟
1)根據(jù)需要準備檢測儀器。對于酶標儀，需輸入樣品描述信息、設(shè)置檢測參數(shù)，并開啟設(shè)定為 37 ± 1°C 的孵育器。
2)按照以下示例檢測板布局，將 100 µL 每種標準品分別加入兩個孔中（此為示例，也可使用其他布局）。
3)按照示例檢測板布局，將 100 µL 陰性對照分別加入兩個孔中。
4)按照示例檢測板布局，將 100 µL 每種樣品稀釋液分別加入兩個孔中。
5)制備陽性產(chǎn)品對照，按照示例檢測板布局（例如樣品 1 加標孔），向兩個孔中分別加入10 µL 濃度為 5.0 EU/mL 的標準品，然后加入 100 µL 樣品稀釋液。對每個檢測樣品均制備陽性產(chǎn)品對照。
6)在樣品分析前，將檢測板在 37 ± 1°C 預孵育至少 10 分鐘。預孵育完成后再加入裂解物試劑。
7)在孵育期間準備裂解物試劑。
8)向所有檢測孔中加入 100 µL 裂解物試劑。將檢測板放入設(shè)置好的酶標儀中，用于動態(tài)顯色法 LAL 檢測，開啟自動混合功能（低強度，10 秒），孵育器溫度設(shè)定為 37 ± 1°C。確認選擇多項式回歸分析。
注：設(shè)置檢測，使用三次多項式曲線評估數(shù)據(jù)，以獲得最佳數(shù)據(jù)擬合。
9)讀取檢測結(jié)果：
按照顯色檢測方法設(shè)定，測量吸光度，檢測時間為 1 小時，或直至最低濃度標準品達到起始吸光度（OD）。由于檢測方法靈敏度較高，需確保檢測時間足夠長，以達到起始 OD 值。
示例檢測板布局：
8 系統(tǒng)要求
1)檢測中標準曲線的相關(guān)系數(shù)（r 值）絕對值必須大于或等于0.980。
2)標準曲線斜率必須在 -0.12 至 -0.35 之間。
3)為確保檢測有效，陰性對照的平均反應時間必須大于最低標準濃度的反應時間，即陰性對照的內(nèi)毒素濃度低于最低標準濃度。
4)為確保樣品不會顯著干擾 LAL / 內(nèi)毒素反應，陽性產(chǎn)品對照的測量內(nèi)毒素濃度必須在等效標準品名義濃度的 50% 至 200% 范圍內(nèi)。在確定陽性產(chǎn)品對照中加標內(nèi)毒素是否回收之前，可能需要減去樣品中測量的內(nèi)毒素濃度，此計算由 Endoscan - V 軟件完成。
5)標準品和樣品重復檢測的變異系數(shù)（% CV）必須≤10%。
若上述任何系統(tǒng)適用性或有效性標準未滿足，則該檢測可能被判定無效，需重復檢測。
9 限值
不得超過 1 EU/mg
10 報告
結(jié)果以 EU/mg 報告，精確到整數(shù)位。未檢測到內(nèi)毒素時，結(jié)果報告為 < 0.05 EU/mg。
注：EU 和 IU 為等效計量單位。
參考文獻：
[1]裴宇盛,陳晨,蔡彤,趙小燕,高華.中、美藥典細菌內(nèi)毒素檢查法應用指導原則的比較和解讀[J/OL].中國藥物警戒:1-8[2022-11-03].DOI:10.19803/j.1672-8629.20211190.
[2] Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China Vol IV(中華人民共和國藥典,四部)[S]. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 19.
[3]The United States Pharmacopeial Convention. U.S.Pharmacopeia 43/ National Formulary 38[M]. Baltimore: United Book Press, 2020.
來源：藥事縱橫
