天堂网www,免费追剧大全在线观看电视剧,97久久精品无码一区二区欧美人 ,日本丰满少妇高潮呻吟

細菌回復突變試驗，是由Ames及其同事最早報道的，故又稱Ames試驗，用于評估潛在致突變或可能的致癌性。Ames試驗結果陽性，通常會假定待測物具有致癌作用，并可能導致候選藥物開發的終止。因此，致突變陽性、陰性的判定對于受試物的開發、監管機構評審、藥物上市等均會產生影響。有多種途徑可用于Ames數據評估，用的比較多的是倍數原則，比如≥平行設置的未經受試物處理組的2倍。另外，雖然沒有普遍認可的統一的統計方法，但統計學方法也是其中一條路徑，通常以p≤0.05計。即≥2倍或p≤0.05認為受試物具有致突變性或潛在致癌性。那么，這種思路究竟有沒有問題呢？

先看下Ames試驗的背景。該試驗是由Ames等人在1973年開發的，后續又有其它團隊做過優化。簡言之，Ames試驗采用基因工程改造的含DNA突變的鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌進行研究，并分為添加或不添加S9的兩種體系。S9是嚙齒類動物肝臟代謝系統，常用的是大鼠肝臟勻漿物。加S9的原因是很多化合物經肝臟代謝后的代謝產物依然有生物活性，而細菌不具備代謝能力。Ames的基本原理是基因突變的沙門氏菌和大腸桿菌分別缺少組氨酸、色氨酸合成能力，在缺少這類氨基酸的培養基中無法存活，如果受試物引起基因突變，使以上菌株恢復組氨酸或色氨酸合成能力，則細菌正常生長，以此判斷受試物的致突變風險。常用的菌株有5種，沙門氏菌TA98、TA100、TA1535、TA97/TA1537二選一、TA102或一株大腸桿菌菌株WP2uvrA/WP2uvrA pKM101。選擇這些菌株的原因是它們具有不同的突變類型、可以檢測不同DNA區域的敏感性、模擬不同DNA修復能力等，盡量增加檢測的廣度和深度，提高試驗的覆蓋面。

試驗通常將1*108細菌暴露在受試物下，設置加或不加S9兩種條件。按照OECD要求，除溶劑和陽性對照外，受試物至少需要設置5個劑量，劑量范圍跨越3個數量級。每個劑量設置三復孔，突變菌落數量取均值。溶劑對照作為突變的背景值，該數值視不同菌株、加/不加S9、不同濃度或不同實驗室操作，可能會有所差異。試驗結果方面，5個菌株中，任意菌株陽性，均認為受試物具有致突變風險。反之，如果受試物被視為無致突變風險，則需要在OECD指定的5種菌株中均進行過測試，且結果都是陰性。

陽性結果的定義

陽性的界定是Ames試驗的關鍵。在任何具備分裂能力的細胞和生物體中，都會存在天然突變。所以，Ames試驗中設置的溶媒對照（受試物劑量為零），背景突變也不是零，這一數值因菌株或其他因素所致也會有差異。問題的關鍵是超過平行設置的溶媒對照多少才視為陽性。

1979年，美國國家毒理學計劃遺傳毒性測試項目指出無論受試物組菌落數較對照組增加幾倍，必須要有可重現的，劑量相關性增加。

OECD 471（1983a）對結果的評價和解釋部分指出有幾個標準可用于陽性結果判定，比如受試物菌落數出現濃度相關增加和/或在至少1個菌株（加或不加代謝活化系統）的1個或多個濃度的每皿菌落數的增加可重現。應首先考慮結果的生物學相關性（biological relevance）。統計學方法可以作為輔助手段，但不能作為判定陽性的唯一手段。OECD 472（1983b）中有過一致描述。

OECD 針對該指南的1997和2020版本指出“there is no requirement for verification of a clear positive response”，對生物學和統計學的描述與之前一致。但是，指南中并未給出clear positive或biological relevance的定義，也沒有提供判斷反應是陽性、陰性還是不確定結果的具體指導或建議。

NMPA 2018年《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》指出，至少在一個菌株上，在有或無代謝活化條件下，受試物所誘發的回復突變菌落數出現濃度依賴性的增加和/或在一個或多個濃度上出現可重復性的增加，可判定為陽性結果。結果判定時應首先考慮試驗結果的生物學意義，統計學分析有助于結果的評價。

如果判定生物學反應是供試品相關的，即陽性，該反應應該是與受試物濃度和/或暴露持續時間相關，并具備可重現性。某些情況下，還需要結合專家判斷、受試系統的生物學特點等綜合判定。

大部分Ames試驗在區分致突變和非致突變方面是沒有問題的，即明確陽性（clearly positive）、明確陰性（clearly negative）。前者可以明確看到濃度依賴性的突變增加，并超過平行設置的溶媒對照，且不需要統計學或進一步計算；后者突變數量與溶媒對照一樣，且沒有濃度依賴性的增加。如下圖化合物A（陽性）和B（陰性）所示。這種類型的陽性和陰性判斷稱之為“inter-ocular rule”，即肉眼可見的判斷，不需要統計也不需要其它形式的分析。

然而，總有些化合物Ames結果的陰性和陽性不是那么明顯。突變增加的不多，且增加的趨勢也不是那么單一，如果下圖化合物C，低濃度不怎么增加，高濃度略有增加。按照2倍規則、3倍規則或者不同統計學處理，會得出不同的結論，可能最終結果就是“不確定”。

傳統常見的陽性判斷方法包括倍數法、ANOVA、95%置信區間、Bernstein模型。前文中的化合物A，無論采用哪種方法，都能得出陽性結論?；衔顱則相反，無論哪種方法都是陰性?；衔顲采用ANOVA或其他統計方法，陽性。采用2倍的倍數規則，則是陰性。95%置信區間法，高劑量落在了平行設置的溶媒對照之外，但可能落在了實驗室歷史溶媒對照的背景數據以內?；衔顲面臨的命運是，如果按照ANOVA或者Berstein模型，則該化合物具有致突變風險，可能會停止開發。如果按照2倍規則，則致突變陰性，有可能繼續推進至臨床階段。

當下使用的判斷標準和路徑

大致分為5種情況：2倍或優化的2倍規則；統計學方法；超過歷史對照范圍；專家判斷；以上多種方法聯合使用。

倍數法

2倍或優化的2倍規則是目前使用最廣泛，也是非常簡便、容易操作的方法。最早源于1975年細菌回復突變發明人Ames團隊，認為小于2倍的增加視為陰性。陽性結果或不確定結果需要進行確認，并有劑量-反應關系。但該實驗室并未給出陽性反應的cut off值。

后續逐漸發現，對于某些菌株如TA1535、TA1537等的背景突變數量只有20或不到，2倍的背景計數視為陽性，不夠保守。Dunkel等人1984年對這一規則進行了修訂，認為對于低背景突變的菌株，超過2.5或3倍背景值方認為是陽性，并被廣泛接受和使用。

不過，倍數法具體怎么操作未形成統一標準。是1個濃度超過2倍或3倍即視為陽性還是至少需要2個濃度達到這一標準？突變數量的增加需要有劑量相關性嗎？三復孔之間的變異度（SD或SEM）需要考慮嗎？沒有達到2倍或3倍，但有明顯的劑量相關增加趨勢是視為陰性還是不確定？

另外，這種嚴格的倍數規則，屬于劃一條線，過線即陽性，忽視了皿與皿之間的差異?？赡軙霈F下表之中的情況，不同皿之間的溶媒對照計數略有差異，按照嚴格2倍規則計算，就會對結論造成影響。化合物B如果溶媒對照與化合物A一致，則致突變結果可能就是陰性或不確定。

統計學

統計學方法有一點與倍數規則法類似，都是通過劃一條線，過線即陽性。只不過統計學是通過p值來定義顯著和非顯著性區分陽性、陰性。當然，倍數法更容易操作和計算。不過，正如倍數法是人為設定的規則，沒有內在生物學意義一樣，統計學方法計算的本質是認為二者沒有差異的可能性小于1/20（以p≤0.05為例）。p=0.052和p=0.049，從統計學角度會給出一個化合物陰性、陽性的結論，但其實二者之間沒有生物學意義的差異，很可能是皿間變異引起。另外，采用不同統計學方法可以得出不同的結論，正如不同實驗室采用不同的倍數界定陽性、陰性一樣。目前為止，披露的統計學方法有很多，如Margolin et al., 1981;Myers et al., 1981; Stead et al., 1981; Bernstein et al., 1982; Snee & Irr,1984; Krewski et al., 1993; Mahon et al., 1989; Leroux & Krewski, 1993;Edler, 1992; Kim &Margolin, 1999。但是，都沒有得到廣泛使用。可能與倍數法更容易使用，不需要專業統計軟件有關，也可能與倍數法對于一些菌株如TA100、TA98更保守有關，亦或者與監管機構更熟悉倍數法有關。

超過歷史背景對照

除了滿足倍數規則或統計顯著性之外，建議陽性反應應該超出歷史背景對照范圍或者分布的上限，可以參考OECD 2014a No.473、OECD 2014a No.474、OECD 2017。歷史對照的上限可以根據95%置信區間確定，也可以采用2或3倍SD設定。

歷史對照也有其局限性，每個實驗室的菌株來源可能不同、S9批次不同、瓊脂和試劑的批號及用量不同、孵育溫度和時間不同、操作人員不同等均對克隆計數造成影響。盡管如此，相較于平行設置的溶媒對照，歷史對照似乎更受重視。但實際上，就具體試驗而言，平行開展的溶媒對照數據更相關。

所以，在評估Ames試驗結果時，歷史對照數據不應該被賦予與同時對照同等或更高的權重，而應該更多地作為評估試驗本身是否可接受的工具。

綜合以上方法

2019年，Levy等人提出可以將倍數法、統計學方法、歷史對照三種方法聯合使用。對于明確的陽性反應，需要同時滿足以上三種標準。反之，陰性反應，則三種方法均是陰性方可。其它情況，則視為可能陽性、可能陰性或不確定性。不過，這個方法并沒有達成共識。其實還是涉及到每種方法如何界定陽性、陰性的問題。

專家判斷

專家判斷的本質是基于主觀的個人經驗和偏見（based on the data reviewer's biases and experience）。但是專家判斷這種主觀方法也有一定的應用場景，比如某些反應相對較弱但可重復，且與濃度相關，但沒有達到一個令人信服的水平以將其定為致突變物，可以通過專家判斷是否應該定為致突變的不確定結論。又比如某些化合物的致突變反應僅限于單一濃度，或結果不可重復的情況。但是，即使同一個實驗室的不同人員對同樣數據也可能得出不同結論，更何況來自不同實驗室的人員。所以，陽性反應的可重復性，專家盲審，可以增強結果的可信度和一致性。

Ames陽性判定方法討論

Ames遺傳毒性測試結果的重要性不言而喻，很多情況下能左右一個化合物的命運。但縱觀各種Ames陽性判定方法，很難界定哪些反應是真正具有生物學意義的陽性反應，哪些反應雖然超過對照水平但并無實際意義。無論實驗室如何定義“生物學相關性”，都難以確定一個明確的界限來區分哪些反應是真正具有生物學意義的陽性反應。這也是Ames試驗的難點所在，雖然FDA和OECD均將生物學層面的相關性置于首位，但何謂生物學相關卻未給出明確定義。雖然大部分試驗結果不難判定，總有些試驗受試物菌落數增加但又達不到實驗室擬定的陽性判定標準，這時可能會有多種其它方法供選擇，而采用不同路徑得到的結果卻又不同。對于這類無法明確陽性或陰性的情況，最好對試驗進行重復，或者采用相同方案，或者對試驗方法進行改進（如受試物濃度間距調整）。這點在ICH S2(R1)有過類似描述，“最理想的是試驗能得到明確的陽性或陰性結果。但是，試驗結果有時達不到預先設定的陽性或陰性結果的判定標準，因此被定為可疑或不確定。統計學方法的應用有助于數據分析。但是，充分的生物學意義分析是至關重要的。對可疑結果進行重復試驗，可得到1）一個明確的陽性結果，因此總體結果為陽性；2）一個陰性結果，所以可疑結果缺乏重現性，總體結果為陰性；3）另一個可疑的結果，最后結論仍維持可疑。

Ames陽性的后續處理

ICH S2(R1)中指出，大量回顧研究顯示許多在Ames試驗中檢出為致突變劑的化合物是嚙齒類動物致癌劑。NMPA《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》也指出Ames試驗能檢出相關的遺傳學改變和大部分嚙齒類動物和人類的遺傳毒性致癌劑。

以上兩個指南均提到，當Ames試驗結果陽性時，提示受試物具有DNA反應性，為評估患者用藥的潛在風險，需進行廣泛的追加試驗評價體內致突變和致癌性潛力，除非通過適當的風險-獲益分析證明是合理的。另外，應對陽性結果進行分析，比如受試物純度，以確定陽性結果是否污染物所致。又如氨基酸污染也會導致菌落數升高，出現假陽性結果，所以Ames試驗不適合檢測可能會降解的肽類。還有一種情況是陽性結果不具備人體遺傳毒性潛力，例如發生細菌特異性代謝（如通過細菌硝基還原酶活化）。

FDA提出，當遺傳毒性結果為陽性時，對進入臨床試驗是否安全，FDA會考慮所有的安全性資料。這些考慮包括對所有遺傳毒性資料的全面徹底的評價和擬進行的臨床試驗的性質。如果這些遺傳毒性試驗的結果提示無潛在的遺傳毒性，臨床研究一般可在健康受試者和擬用臨床適應癥的病人中進行。若出現明確的陽性結果，需要提供有關遺傳毒性機制的證據以及這種機制與預期體內暴露的相關性，或者排除DNA作用機制。