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嘉峪檢測網 2025-03-20 08:20
在液相色譜分析中，我們會遇到各種問題，需要分析人員有足夠的知識和能力來解決這些問題。本期筆者將翻譯一篇綜述，原文為：【Necessary Analytical Skills and Knowledge for Identifying, Understanding, and Performing HPLC Troubleshooting】（即識別、理解和執行 HPLC 故障解決所需的分析技能和知識）。
流動相緩沖液
緩沖液的選擇和制備
流動相中緩沖液的作用是防止 pH 值發生變化。當樣品或色譜柱中含有酸性或堿性成分時，就需要使用緩沖液。為精確控制 pH 值，緩沖液應在其最大緩沖能力下使用，即在其 pKa 的 ±1 個 pH 單位范圍內使用。與緩沖液 pKa 相差 2 個 pH 單位時，緩沖能力會下降 25 倍。制備緩沖液的常見方法包括：
使用緩沖液計算器程序，如 ([https://www.zirchrom.com/pass. asp])；
使用 Henderson-Hasselbalch 方程；該方程提供了酸（或堿，在水溶液中）的 pH 值與其 pKa（酸解離常數）之間的關系。當已知酸（堿）及其共軛堿（酸）的濃度時，可借助該方程估算緩沖溶液的 pH 值。
通過滴定直到達到目標 pH 值。
磷酸鹽緩沖液易于制備、純度高、pH 值范圍合適、紫外吸收率低。但是，它們不是質譜（MS）友好型緩沖液。磷酸鹽緩沖液適用于以下 pH 值范圍：2-3.1 和 6.2-8.2。乙酸鹽緩沖液因其揮發性而對質譜儀友好，但應注意防止選擇性蒸發。建議在高 pH 值條件下使用有機緩沖液，而不是磷酸鹽緩沖液，以盡量減少硅膠的溶解。可使用的高 pH 值緩沖液有三(羥甲基)氨基甲烷、吡咯烷、三甲胺和甘氨酸等，如果可能，建議在 A 相（水相）和 B 相（有機相）中使用相同濃度的緩沖液 。
水有機混合物中的緩沖液
部分水溶液的 pH 值難以解釋，而且與水溶液不同。
與有機溶劑存在相關的 pH 值變化有四個原因：
由于有機溶劑的存在，pH 傳感電極和參比電極之間的金屬塊上產生了小電流，導致交界電位發生變化。這種變化導致校準標準和樣品的結點電位不同。
解離常數的變化（KW = 10-14）。在水溶液中，[H]+=[OH]- 時為中性，而在甲醇中，[H]+=[CH3O]- 時為中性。因此，pH=7 不再是甲醇的中性狀態，而是 8.3。
溶液性質（如溶劑成分或溫度）的變化導致 pH 值的變化。
緩沖 pKa 的變化。與水相比，有機溶劑的介電常數較低，因此離子的解離方式不同。如果有機成分在溶劑中的比例低于 50%，則水性溶劑和水性有機溶劑的 pH 值差異最小。不過，如果將有機溶劑中的 pH 值與水溶劑中的 pH 值進行比較，兩者之間的差異可能高達兩個 pH 單位或更多。
離子對試劑的優勢和劣勢
分析人員的主要選擇是在低 pH 值（2~3）條件下操作，在這種條件下有多種色譜柱可供選擇。在低 pH 值條件下，酸性和中性樣品不會被電離，可以很好地保留下來。另一方面，堿性樣品會被質子化并保留下來（如果它們有一個主要的非極性鏈），如果分子是極性的，則不會被保留下來。
離子對試劑具有離子末端和非極性尾部，將其加入流動相中可提高極性分子的保留率。保留增強的機理如下。首先，離子對試劑的非極性尾部被固定相中的非極性鏈緊緊抓住，而離子部分則被導向流動相。
然后，離子對試劑的離子部分將保留電荷相反的離子化合物。對于帶正電荷的離子堿，可使用帶負電荷的離子對試劑，如烷基磺酸。帶負電荷的離子酸可使用帶正電荷的離子對試劑，如四丁基氯化銨。
圖 1. 十二烷基磺酸鈉（上圖）和四丁基氯化銨（下圖）。
添加離子對試劑會降低方法的穩健性。但有時，當一些離子化峰在死體積中洗脫時，添加離子對試劑就能解決分離問題。需要注意的是，添加離子對試劑后，中性化合物的保留時間會縮短，因為離子對試劑會占據部分固定相。在為等度方法選擇離子對試劑的最佳濃度時，建議使用兩種流動相，一種含離子對試劑，另一種不含。通過混合兩種流動相，逐步提高離子對試劑的濃度，直到第一個峰的保留因子大于 1，即可找到離子對試劑的最佳濃度。可通過改變溫度、pH 值或甲醇的百分比來微調保留因子。
圖 2. 離子對試劑示意圖
在使用離子對試劑時需要注意一些事項：
固定相中離子對試劑的濃度取決于有機相比例和溫度；
固定相中離子對試劑的濃度平衡較慢，即需要 20-50 個柱體積才能平衡；
某些離子對試劑具有很強的紫外吸光度；
離子對試劑不易從柱上洗掉；
使用微量離子對試劑會改變選擇性。由于溫度變化、pH 值變化、流動相和樣品溶劑之間的 pH 值不匹配、離子對濃度不足以及使用 pH 值調整過的流動相而非真正的緩沖液，使用離子對的方法的保留時間可能會發生變化。
離子對試劑的替代品包括：
三氟乙酸，因為它可作為大生物分子的離子對試劑，且平衡速度快；
極性嵌入相柱或適用于 100% 水的柱子；
如果所有樣品都離子化，則使用離子交換代替離子對試劑；
混合模式固定相，其電荷靠近烷基固定相鏈的基部。
來源：Internet
