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嘉峪檢測網 2025-03-20 08:24
1. 實驗原理
考馬斯亮藍染色是一種常用的蛋白質檢測方法，其原理基于考馬斯亮藍（如R-250和G-250）與蛋白質分子的結合。
當染料與蛋白質結合時，其分子構象發生改變，形成藍色復合物并富集于蛋白質表面的疏水區域，凝膠中原本透明的蛋白質條帶因染料聚集而顯現藍色。
這一顯色機制主要由染料磺酸基團與蛋白質堿性氨基酸殘基（如精氨酸、賴氨酸）之間的靜電引力驅動，同時伴隨范德華力和疏水相互作用的協同效應。
顯色強度與靶蛋白中堿性氨基酸的豐度及染料結合效率密切相關。
圖片來源：https://images.app.goo.gl/iswfooKkfNQNZrK78
考馬斯亮藍分為G-250和R-250兩類。
G-250在游離狀態下呈紅色，最大吸收波長為465 nm；與蛋白質結合后轉變為藍色，復合物的最大吸收峰移至595 nm，且吸光度與蛋白質濃度成正比。由于結合迅速，G-250常用于溶液中的蛋白質定量（如Bradford法）。
R-250與蛋白質結合速度較慢，但可通過甲醇-乙酸溶液去除未結合的染料（脫色步驟），因此更適用于電泳凝膠中蛋白質條帶的染色。
2. 實驗材料
耗材：SDS-PAGE凝膠、染色槽
試劑：
考馬斯亮藍R250染色液：稱取0.25 g考馬斯亮藍R250，加入45 mL甲醇和10 mL冰醋酸，用超純水補足至100 mL，充分混勻。
脫色液：取250 mL甲醇與80 mL冰醋酸混合，再用超純水定容至1000 mL，混合均勻后備用。
ddH2O
設備：搖床、電泳儀
3. 實驗步驟
3.1 電泳
通過SDS-PAGE電泳來分離蛋白質，在這個過程中，要按照蛋白質的大小和其所帶電荷的狀況，選擇濃度適宜的凝膠（小分子用濃度大的，大分子用濃度小的）。
3.2 染色
電泳結束后，將凝膠取出，用水沖洗干凈。隨后加入考馬斯亮藍染色液完全浸沒，并在室溫下搖床染色約30 min或更長，轉速為50-150r/min，具體時間可依據凝膠厚度和實驗條件調整，直至顏色接近染液。
3.3 去染
染色結束后，棄去或回收染色液（一般可重復使用2-3次）。隨后進行脫色處理，一般脫色時間為2-3 h，期間需更換脫色液，直至藍色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶清晰可見。如需背景更低的凝膠，則需用純水浸泡過夜。
3.4 拍照和分析結果
脫色完畢后應盡快拍照，防止凝膠上蛋白和染料的流失。
如圖所示為考馬斯亮藍染色的結果圖：按照從左到右的順序，在電泳實驗中依次加入上樣量為20 μg和10 μg的Hela細胞裂解液，以及上樣量為500 ng、100 ng、50 ng、10 ng的BSA純化蛋白的考馬斯亮藍染色后的膠圖。
BSA純化蛋白組為陽性對照，可進一步評估蛋白分離效果，因為BSA純化蛋白的分子量相對明確且單一，在電泳過程中會根據其分子量大小在凝膠中遷移到特定位置。
圖片來源于：https://bio.vazyme.com/products_7/28.html
4. 注意事項
染色時間取決于凝膠厚度和溫度。較厚的凝膠或較低溫度需延長時間，較薄的凝膠或較高溫度則可縮短。一般當凝膠顏色接近染液且難以分辨時，說明染色已完成。適當延長至2～4 h或更久，不會影響最終效果。
脫色完成后，可將凝膠浸泡在水中以備拍照或其他后續操作。但長期浸泡可能導致凝膠溶漲，若需避免，可存放于20%甘油溶液中。此外，凝膠也可制備成干膠以便長期保存。
在蛋白免疫印跡技術體系中，考馬斯亮藍與麗春紅作為互補性染色劑被廣泛應用于不同檢測階段，考馬斯亮藍G-250染色液可達成以下三個目的：
驗證電泳參數有效性（如電流設置、膠體濃度匹配度）；
評估轉膜完整性（未轉出蛋白在凝膠對應分子量位置仍殘留可見條帶）；
純化蛋白實驗時檢測目的蛋白是否被純化出來。
與之形成對比的是，麗春紅憑借其可逆結合特性，常被用于短暫染色PVDF/NC膜，通過肉眼觀察紅色條帶分布既可快速判斷轉膜均勻性，又能在BSA封閉液處理前通過脫色緩沖液（TBS-T）完全去除染料，避免干擾后續抗體結合。
來源：實驗老司機小米
