您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發
嘉峪檢測網 2025-02-13 08:48
摘要
遺傳毒性試驗是藥物非臨床安全性評價的重要組成部分，主要用于藥物早期致癌性風險評價。近年來，新靶點和創新藥效結構的藥物大量涌現，遺傳毒性或致癌性結果呈陽性的創新藥物數量大幅增加。然而，有研究顯示細菌回復突變試驗(Ames)結果為陽性的化合物中約1/3為非致癌物。本文回顧了致突變性與致癌性風險間的關聯，Ames試驗陽性結果的原因及當前國際上對Ames試驗陽性結果的藥物的監管要求，總結了可供選擇的后續體內試驗方法，并提出當藥物在非臨床安全性評價中Ames試驗結果為陽性時的評價思路和機制研究策略，為藥物研發及評價提供借鑒。
【關鍵詞】 Ames試驗；陽性結果；后續試驗；轉基因嚙齒動物；Pig-a基因突變試驗；下一代測序
遺傳物質損傷與腫瘤的形成存在一定關聯。近年來，新靶點和創新藥效結構的藥物大量涌現，遺傳毒性或致癌性結果呈陽性的創新藥物數量大幅增加。回顧性文獻認為，遺傳物質致斷裂性風險通常與受試物的直接毒性有關[1]，染色體或DNA的斷裂性與劑量存在一定關聯，可通過降低暴露量而避免染色體損傷風險。然而，致突變性作用則無劑量效應相關性，不可修復的突變形成后，可在不斷復制過程中逐漸發展為腫瘤。在美國 《醫師案頭參考(1999)》 清單列出的 352 個非抗癌藥物中，29%至少有一項遺傳毒性試驗為陽性，201種藥品的標簽中注明了遺傳毒性和致癌性結果為陽性，38%的致癌性數據為陽性，8.3%的細菌回復突變試驗(Ames 試驗)結果為陽性[2]。又如，蒽醌類[3]和黃酮類[4]等中藥中的常見成分Ames試驗結果也為陽性，該類成分在我國已有上千年的服用歷史。由此引發了以下兩個問題：①當前在監管領域常用的遺傳毒性試驗方法是否可以科學地對創新藥物的人體致癌性風險進行預測？②Ames試驗結果為陽性的創新藥物應采取怎樣的評價策略？
本文聚焦細菌致突變性數據與致癌性風險的關聯，綜述了Ames試驗陽性結果的原因，并提出了Ames試驗陽性結果的后續研究策略，為藥物遺傳毒性研究和監管提供參考。
1、致突變性與致癌性
基因突變可增加人類患癌和遺傳性疾病的風險，對健康產生深遠影響。Hermann Muller最早于1927年報道了暴露于X射線的果蠅會產生新的遺傳性狀，證明了暴露于環境因素會改變生物體的基因組成[5]。自1953年DNA結構的發表及隨后DNA聚合酶的描述，逐漸將環境暴露與突變和遺傳變化聯系起來[6]。20世紀70年代中期，通過嚙齒動物致癌性研究數據表明大多數已知誘變劑均具有致癌性。
致癌物按照作用機制可分為對DNA造成直接損傷的遺傳毒性致癌物和不直接造成DNA損傷的非遺傳毒性致癌物，即表觀遺傳性致癌物。其中遺傳毒性致癌物的致突變性作用，理論上沒有閾值[7]。50多年來，致癌性與致突變性之間的密切關聯一直是遺傳毒性研究的驅動力。突變導致癌癥重要的第一步是DNA損傷，致癌物可以導致DNA加合物的形成，誘發DNA的其他修飾，也會導致 DNA 鏈交聯、斷裂和染色體的缺失重排[8]。非遺傳毒性致癌物無致突變性，但有閾值反應，在一定范圍內不會產生不良影響，主要以DNA甲基化或組蛋白乙?；瘍煞N方式影響某些基因的表達。本文聚焦致突變性和致癌性的風險評估。
2、Ames試驗
Ames 試驗由 Bruce N. Ames 于 1973 年首次報道，當前已成為全球范圍內用于化學品和藥物致突變性風險初步篩選的首選試驗方法。該方法基于營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(如TA97a、TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535 和 TA1537 等)和大腸桿菌(WP2和WP2urvA)開展。在誘變劑作用下，缺陷基因反向突變，使細菌自主合成必需氨基酸并在培養基中形成可見菌落，從而通過菌落計數來評價受試物的致突變性風險。鑒于Ames試驗簡單靈活、成本效益好，并建立了經驗證的大型數據庫，當前已基于化合物的結構特征、Ames 試驗數據和計算拓展分析技術開發了多種體外致突變性風險檢測模型。如Hansen 等[9]構建的包含6500種化學物質以及沙門氏菌檢測數據和結構信息的基準數據集，以及Vian等[10]開發的可評估S9組分代謝活化對Ames計算機模型的影響的預測模型等。
2.1 Ames試驗陽性藥物的監管現狀
通常Ames試驗結果呈陽性的化合物被視為存在體內致突變性風險或致癌性風險。美國食品藥品監督管理局(Food andDrug Administration，FDA)允許Ames試驗陽性藥物在健康受試者中進行單次給藥試驗。某些監管機構則允許超過單次的使用，如英國藥品和健康產品管理局(Medicines and HealthcareProducts Regulatory Agency，MHRA)認為在健康受試者中使用存在遺傳毒性的受試物時需要提供具體的理由，當理由充分(如基于毒理學關注閾值的風險評估數據、藥物半衰期數據、人臨床擬用劑量范圍等)時，可在臨床給予單劑量的 Ames 陽性藥物。如無充分的理由，單劑量給予周期不可超過1周。此外，人用藥品注冊技術要求國際協調會(International Council forHarmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticalsfor Human Use，ICH)發布的 ICH M3(R2)指導原則[11]指出如藥物無警示結構，可以100 μg/d的劑量分5次給予，該劑量為臨床試驗中使用藥理活性劑量的1/1 000~1/10以下。德國聯邦藥品 和 醫 療 器 械 機 構 (Bundesinstitut für Arzneimittel undMedizinprodukte，BfArM)也允許在健康受試者中使用微劑量的Ames 陽性藥物。然而，加拿大衛生部則認為如果沒有后續研究證明該類藥物在體內無致突變性，則不允許其在健康受試者中進行臨床試驗。日本監管部門也不允許在健康受試者中使用Ames陽性藥物。中國自加入ICH以來，對Ames陽性藥物的監管主要參考ICH指導原則。
2.2 Ames試驗陽性藥物的機制探索
Ames試驗的陽性結果與致癌性風險密切相關，但Ames試驗結果也可能是由多種因素影響產生的假陽性結果，因此對Ames陽性結果的機制探索十分重要。
2.2.1 雜質
Ames試驗陽性結果可能由低濃度的致突變性雜質引起，這些雜質在ICH M7(R2)指導原則中屬于1類和2類雜質。對于已知具有致突變性和致癌性的1類雜質，首先考慮去除，如果無法去除，則應建立基于未觀察到作用水平(noobserved effect level，NOEL)致癌性數據的限度數值。監管評估的常規方式是根據致癌性劑量反應數據采用線性低劑量外推法，即以誘導50%腫瘤發生率的劑量(TD50)的五萬分之一為攝入量，將腫瘤的發生風險控制在十萬分之一。對于已知致突變性但致癌性未知的2類雜質，如存在閾值相關機制，以每日允許暴露量(permitted daily exposure，PDE)求限度值；如無閾值相關機制的證據，根據毒理學關注閾值(threshold of toxicologicalconcern，TTC)確立限度。如2007年在抗HIV藥物Viracept中發現了遺傳毒性雜質EMS，Gocke 等[12]開展多劑量的轉基因小鼠致突變性試驗，并結合微核試驗和組織中加合物檢測，得到25 mg/(kg·d)為EMS致突變效應的起始閾值，且該劑量下重復給藥無蓄積效應。Viracept 中 EMS 的人體最大暴露劑量為0.055 mg/(kg·d)，遠低于致突變作用閾值。故認為使用Viracept的患者不會因接觸 EMS而出現任何額外的毒理不良反應。
但有些高致突變致癌物被稱為“關注隊列”，即使攝入量低于TTC，理論上仍會具有高致癌風險，主要包括黃曲霉毒素樣化合物、N-亞硝基化合物和烷基氮氧化合物。其中N-烷基亞 硝 胺 例 如 N-亞 硝 基 二 甲 胺 (NDMA) 和 N-亞 硝 基 二 乙 胺(NDEA)，是已知的對大鼠具有遺傳毒性的致癌物質。這類物質具有非線性劑量反應和實際閾值，風險評估不能使用TTC。遵循ICH建議，Johnson等[13]使用已發表的嚙齒動物癌癥生物測定和體內致突變性數據計算NDMA對癌變和突變的PDE分別為每人 6.2 和 0.6 μg/d，NDEA 對癌變和突變的 PDE 分別為每人 2.2和0.04 μg/d，均高于簡單線性外推得出的可接受的每日攝入量(NDMA為96 ng，NDEA為26.5 ng)。這為使用基準方法的PDE計算提供了更可靠的暴露限值評估并且可以更好地告知患者的風險。
2.2.2 化學結構
藥物的結構成分之間相互干擾可能產生毒性，從而使 Ames 結果為陽性。“警示結構”一詞由 Ashby[14]在1985年定義致癌性的結構基礎時引入，它是與化學物質的致癌和致突變特性相關的分子結構或活性基團，不僅對潛在致癌物的分類非常有幫助，而且對理解遺傳毒性機制也很重要。Perez-Garrido 等[15]提出了一系列針對致突變性的警示結構，表明致突變性與疏水性和分子體積之間存在相關性，創建的模型一致性為86%，正確分類了95%的致突變物質。Amberg等[16]證明在使用DMSO 作為媒介的Ames 試驗中，產生陽性結果的18種酰基或磺酰鹵化學品中有15種在使用水為媒介時產生陰性結果。這可能是由于?；蚧酋｛u在DMSO中進行?；a生鹵代甲基硫醚，也可能是在水中分別水解為非誘變碳酸和鹵化氫或磺酸和鹵化氫。由此可以得出?；蚧酋｛u是Ames致突變性的警示結構。
國際上提出采用警示結構作為區分普通雜質和遺傳毒性雜質的重要依據，這一概念也成為遺傳毒性警示結構以及定量構效關系(quantitative structure activity relationship，QSAR)模型的基礎。ICH M7 指南允許在試驗數據不足時使用計算機 QSAR方法來預測細菌致突變性，使用兩種互補的方法即基于專家規則和基于統計搜索是否存在警示結構是將雜質分類為3、4或5類的第一步。在基于規則的系統中，定性預測基于化學品的警示結構，因為警示結構周圍的電子密度和空間環境及分子的大小和形狀等可能影響預測結果。在輸入藥物特有的信息后，QSAR模型會自動與已有數據比較，根據結構相似程度，判斷是否存在警示結構。將警示結構與QSAR模型相結合可以提高毒性預測的準確性，減少未來候選藥物產生不良毒性作用的可能性[17]。
2.2.3 代謝產物
細菌和哺乳動物具有不同的新陳代謝能力，與哺乳動物細胞相比，細菌能夠有效地將硝基和偶氮化合物活化為親電代謝物。為了提高其代謝能力，在Ames試驗體系中常加入哺乳動物肝 S9，但在有利于高水平氧化酶代謝的條件下，Ames試驗結果可能為陽性。Ames試驗陽性藥物相關代謝物與2年嚙齒類動物致癌性生物測定具有高度相關性，如Ames試驗陽性藥物相關代謝物低于全身總暴露量的10%，則應考慮原料藥劑量、代謝物中活性官能團性質等進行后續測試。根據ICH M3 (R2)指南，如果Ames試驗陽性藥物相關代謝物大于全身 總 暴 露 量 的 10% ， 則 可 能 以 處 理 藥 物 活 性 成 分 (activepharmaceutical ingredients，API)類似的方式處理。藥物代謝物在結構上存在致突變性，則需要特別關注。如酰胺形成的鍵對酶或酸催化的水解具有潛在的不穩定性，從而產生游離的芳香胺，后者可作為雜質或代謝物或降解物出現。在這種情況下，既將其作為雜質，又要將其作為代謝物進行Ames試驗。
2.2.4 氧化劑
多種化學物質可通過產生活性氧(reactiveoxygen species，ROS)誘導 DNA 損傷，如農藥、溶劑(如氯仿、四氯化碳和酚類)、兒茶酚和兒茶酚胺、雌激素、金屬和苯并[a]芘等。當產生的ROS濃度超過抗氧化劑清除能力時，對細胞有害并導致DNA、蛋白質和脂質等細胞大分子受損。最終，ROS的積累會引起氧化應激，導致細胞死亡[18]。一些藥物在Ames試驗中呈陽性但在哺乳動物細胞試驗中結果為陰性，此時需考慮是否與氧化應激作用機制有關。Ames 菌株應對特定氧化應激的能力各不相同，TA97、TA100、TA102 對氧化應激更敏感。Kirkland等[19]在不影響S9的代謝活化條件下，在Ames試驗系統中添加抗氧化劑。氧化劑乙二醛在無代謝活化條件下導致TA100 和 TA1535 菌株的回復菌落數大幅增加，結果均為陽性，提示其有致突變性。經超氧化物歧化酶預處理后，乙二醛誘導的TA100回復突變菌落數減少66%，TA1535減少40%。經過氧化氫酶預處理后，TA100減少60%，TA1535減少21%。
3、體內致突變性試驗
體內遺傳毒性試驗通常是標準試驗組合的一部分，可以提供影響化合物遺傳毒性的其他相關因素如吸收、分布、代謝和排泄等。在 Ames 試驗陽性結果的后續體內研究試驗選擇中，Zeller等[20]建議首先開展骨髓和血液微核試驗，并結合涵蓋其他相關組織的彗星試驗。Kirkland 等[21]發表的一項關于體內遺傳毒性試驗對人類致癌物性能評估的研究表明，骨髓微核和彗星試驗相結合，可以檢出約95%的人類致癌物。雖然彗星和微核試驗對可能最終導致基因突變的DNA損傷都很敏感，但這兩種檢測方法的檢測對象為大范圍的遺傳物質損傷，不能直接檢測基因突變。ICH S2(R1)指出，對于 Ames 試驗陽性藥物，后續試驗應以評估致突變性終點為基礎，其目的是確定體外基因突變結果是否與體內基因突變結果相關，即與體內結果具有生物學相關性。OECD于2011年頒布的TG488指導原則提供了使用轉基因嚙齒動物模型評估生殖細胞和體細胞致突變性的建議，2020 年發布相關指導原則，指出當 Ames 試驗結果不明確時，體內Pig-a基因突變試驗可作為后續試驗方法選擇，以下分別對這兩種方法進行闡述。
3.1 轉基因嚙齒動物致突變性試驗
轉基因嚙齒動物(transgenic rodent，TGR)致突變性試驗作為經典的體內遺傳毒性評價方法至今已有20多年的歷史。該方法可利用肝、腎等不同組織對基因突變進行檢測，突破了體內遺傳毒性評價方法僅使用造血組織為檢測終點的局限。TGR主要利用 MutaTM小鼠、Big Blue®小鼠和大鼠、LacZ 質粒小鼠和 gptdelta 小鼠和大鼠，檢測由復制過程中堿基配對或結合錯誤或DNA序列重排引起的小規模遺傳損傷。在嚙齒動物給藥中最高劑量應為最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)，可以根據死亡率、體質量減輕等標準終點來確定或通過臨床觀察選擇。Luan 等[22]建立了一種對肝臟細胞色素 P450 還原酶無效的gpt delta 轉基因小鼠模型，以評估4-甲基亞硝基胺基-1-3-吡啶 基-1-丁 酮 [4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK]誘發的基因突變。試驗顯示NNK不能在沒有P450代謝激活的情況下誘導肝臟突變，但可以通過肝臟P450獨立的機制誘導肺部突變，模型有助于確定肝臟與肝外 P450 介導的突變作用，以及P450與其他生物轉化酶在遺傳毒性致癌物激活中的作用。TGR 原則上可以與其他體內遺傳毒性試驗相結合，與Pig-a基因突變試驗相結合，有助于減少費用和嚙齒動物的使用，是檢測Ames陽性結果后續工作的潛在方法。但轉基因動物成本較高，某些特定的動物品系依賴從國外進口，不僅價格昂貴，而且進口周期漫長且渠道單一，不具有普適性。此外，TGR檢測依賴特定報告基因的表達，檢測結果可能存在偏倚。試驗需要特殊檢測試劑，價格昂貴，技術門檻高。轉基因動物的檢測結果外推至人體還存在一定差距。
3.2 體內Pig-a基因突變試驗
體內Pig-a基因突變試驗是考察外源物質導致的體內致突變風險的最有前途的試驗方法。該方法主要通過流式細胞儀對細胞進行免疫熒光標記和分析，隨時監測糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)錨相關表面蛋白的表達缺失情況，作為Pig-a基因突變的指標。Pig-a試驗以外周血作為檢測對象，突變細胞在外周血中出現的時間取決于細胞和GPI錨的周轉率，以及特定細胞類型從骨髓到外周的運輸時間。Nishimura 等[23]報告了在陣發性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmalnocturnal hemoglobinuria，PNH)患者的Pig-a基因中發現的一系列體細胞突變，包括堿基置換以及不同大小的插入和缺失，幾乎所有病例的PNH診斷都與Pig-a基因突變有關。Dertinger等[24]進一步將高通量免疫磁性篩選技術引入 Pig-a 基因突變試驗，從而有效提高了細胞分析的數量與統計功效。OECD在2022年發布了體內Pig-a基因突變試驗指導原則TG470，給體內基因突變的實驗設計帶來了更多選擇。近年來，以TK6、MCL-5以及L5178Y等哺乳動物細胞系開展的Pig-a基因突變試驗也取得了一些進展[25]，但目前尚處于研發階段。與TGR基因突變檢測不同，Pig-a檢測不局限于特定的動物品系，可以與重復劑量毒理學研究和其他遺傳毒理學試驗相結合，符合3R原則，同時只需采取微量外周血樣本，不會影響其他終點的評估。但Pig-a也具有一定局限性，它只能在紅細胞和網織紅細胞中進行。因此，需證明目標組織對藥物或其代謝物的相關暴露。IWGT工作組建議可以將Pig-a與下一代測序或深度測序相結合，從而形成可應用于大鼠以外試驗體系和其他造血細胞的新方法[26]。
4、下一代測序技術
在使用具有潛在遺傳毒性的藥物治療后，細胞基因突變頻率對于危害評估十分關鍵。已經建立的體外體內遺傳毒性試驗和轉基因動物模型不能提供整個基因組序列完整性信息。下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術提供了多種研究基因組的方法，包括整個基因組、外顯子組和轉錄子組的測序。NGS技術不依賴任何特定的基因或細胞系，具有高通量和大規模并行測序的能力，可以同時篩選多個樣本中的各種基因組變化。盡管NSG明顯優于傳統Sanger測序，但在DNA制備、擴增和測序過程中經常出現低水平測序錯誤和偽影，可導致高達1%的人工突變頻率，遠遠高于正常組織的正常每個核苷酸突變頻率(<1×10-7)，且在某些序列背景下，可能會更高。因此，為了檢測更低頻率的突變并提高測序準確度，需要開發更靈敏的NGS技術。
目前認為降低低頻測序錯誤率最有效的策略是分子一致性測序，基于單鏈或互補鏈對同一模板來源的多個拷貝進行錯誤校正。Schmitt 等[27]通過對 DNA 互補鏈添加分子標記，開發了Duplex Sequencing方法，測序錯率低至1×10-7，但測序深度和成本高，所需拷貝數多，不適用于大型基因組。Hoang等[28]在Duplex Sequencing基礎上開發BotSeq，對PCR擴增后的文庫進行稀釋達到提高測序效率的目的，可用于全基因組測序。Abascal等[29]又在BotSeq基礎上開發了NanoSeq，引入特定限制性內切酶和ddBTPs，降低文庫制備損傷和末端修復錯誤，測序效率高，錯誤率降低至 1×10-8。為了避免 PCR 擴增引入的偽影，2020年，You等[30]開發了一種無PCR的縮短雙鏈獨立一致性的測序方法 PECC-Seq(paired-end complementary consensussequencing)，以剪切點為內源標記，進一步簡化文庫制備及后續生物信息學分析，理論錯誤率可降低至1×10-9。在全基因組范圍內的低頻測序表現出較高的準確度和較好的成本效益，在臨床液體活檢、癌癥研究等領域具有潛在的應用前景。應進一步對新的低頻測序方法進行研究，以繼續擴大測序應用范圍。
5、小 結
化合物的Ames試驗結果為陽性時，首先應分析陽性結果產生的原因。鑒于遺傳毒性試驗方法基于特定檢測終點而形成的特點，應充分考慮Ames試驗結果是否與細菌試驗體系的特殊性或受試物的特殊作用機制有關，是否與細菌特定的代謝活化體系有關，是否與存在特定的警示結構有關。建議使用相關結構化合物或在調整試驗條件后開展比較研究，以判斷是否可排除其人體致癌性風險。后續可選擇以基因突變為檢測終點的評價方法包括，小鼠淋巴瘤細胞試驗、體內Pig-a基因突變試驗和TGR 致突變性試驗等(表1)。當前下一代測序技術國際上正在研發階段。除上述以致突變性為檢測終點的試驗方法外，也可考慮開展轉基因小鼠6個月致癌性試驗，從而在有限的時間和經濟成本內獲得TD50數據用于風險評估。此外，也可開展多劑量的體內致突變性/致癌性試驗，驗證其是否具有作用閾值。開展體內研究時可伴隨開展藥代/毒代動力學、組織加合物檢測、突變譜檢測等機制研究，從而進一步了解其致突變性作用特點，為同類藥物的設計與合成提供重要參考。
▲表1-致突變性檢測方法比較
綜上所述，遺傳毒性試驗是藥物非臨床安全性評價的重要組成部分，主要用于藥物早期致癌性風險評價。本文回顧了致突變性與致癌性風險間的關聯，以及Ames試驗陽性結果的原因及當前國際上對Ames試驗為陽性結果的藥物監管要求，總結了可供選擇的后續體內試驗方法，并提出當藥物在非臨床安全性評價中Ames試驗結果為陽性時的評價思路和機制研究策略，為藥物研發及評價提供借鑒。
參考文獻
[1]DISHOTSKY N I, LOUGHMAN W D, MOGAR R E, et al. LSD andgenetic damage[J]. Science, 1971, 172(3982): 431-440.
[2]SNYDER R D, GREEN J W. A review of the genotoxicity of marketed
pharmaceuticals[J]. Mutat Res, 2001, 488(2): 151-169.
[3]王亞楠, 王雪, 汪祺, 等. 基于毒理學軟件和細菌回復突變試驗的大黃素型蒽醌基因突變風險評價[J]. 藥物評價研究, 2022, 45(7): 1240-1247.
[4] RESENDE F A, VILEGAS W, DOS SANTOS L C, et al. Mutagenicity of
flavonoids assayed by bacterial reverse mutation (Ames) test[J].Molecules, 2012, 17(5): 5255-5268.
[5]MULLER H J. Artificial transmutation of the gene[J]. Science, 1927, 66
(1699): 84-87.
[6]BESSMAN M J, LEHMAN I R, SIMMS E S, et al. Enzymatic synthesis
of deoxyribonucleic acid. II. General properties of the reaction[J]. J Biol
Chem, 1958, 233(1): 171-177.
[7] KIRSCH-VOLDERS M, AARDEMA M, ELHAJOUJI A. Concepts of threshold in mutagenesis and carcinogenesis[J]. Mutat Res, 2000, 464
(1): 3-11.
[8]PLOŠNIK A, VRA?KO M, DOLENC M S. Mutagenic and carcinogenic
structural alerts and their mechanisms of action[J]. Arh Hig Rada
Toksikol, 2016, 67(3): 169-182.
[9]HANSEN K, MIKA S, SCHROETER T, et al. Benchmark data set for in
silico prediction of Ames mutagenicity[J]. J Chem Inf Model, 2009, 49
(9): 2077-2081.
[10] VIAN M, RAITANO G, RONCAGLIONI A, et al. In silico model formutagenicity (Ames test), taking into account metabolism[J].Mutagenesis, 2019, 34(1): 41-48.
[11] ICH. Guidance on Nonclinical Safety Studies for the Conduct of HumanClinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals [EB/OL]. (2017-02-15) https: //database.ich.org/sites/default/files/M3_R2_Guideline.pdf.
[12] GOCKE E, MÜLLER L. In vivo studies in the mouse to define a
threshold for the genotoxicity of EMS and ENU[J]. Mutat Res, 2009, 678
(2): 101-107.
[13] JOHNSON G E, DOBO K, GOLLAPUDI B, et al. Permitted daily exposure limits for noteworthy N-nitrosamines[J]. Environ Mol Mutagen,2021, 62(5): 293-305.
[14] ASHBY J. Fundamental structural alerts to potential carcinogenicity ornoncarcinogenicity[J]. Environ Mutagen, 1985, 7(6): 919-921.
[15] PÉREZ-GARRIDO A, HELGUERA A M, RODRÍGUEZ F G, et al.QSAR models to predict mutagenicity of acrylates, methacrylates and alpha, beta-unsaturated carbonyl compounds[J]. Dent Mater, 2010, 26(5): 397-415.
[16] AMBERG A, HARVEY J S, CZICH A, et al. Do carboxylic/sulfonicacid halides really present a mutagenic and carcinogenic risk asimpurities in final drug products?[J]. Org Process Res Dev, 2015, 19(11): 1495-1506.
[17] ALVES V, MURATOV E, CAPUZZI S, et al. Alarms about structural
alerts[J]. Green Chem, 2016, 18(16): 4348-4360.
[18] WANG E Y, HUANG Y, DU Q Y, et al. Silver nanoparticle induced
toxicity to human sperm by increasing ROS(reactive oxygen species)
production and DNA damage[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2017, 52:
193-199.
[19] KIRKLAND D, ZEIGER E, MADIA F, et al. Can in vitro mammalian
cell genotoxicity test results be used to complement positive results in the Ames test and help predict carcinogenic or in vivo genotoxic activity? I. Reports of individual databases presented at an EURL ECVAM Workshop[J]. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen, 2014, 775/776: 55-68.
[20] ZELLER A, BRIGO A, BRINK A, et al. Genotoxicity assessment of drug metabolites in the context of MIST and beyond[J]. Chem Res Toxicol, 2020, 33(1): 10-19.
[21] KIRKLAND D, LEVY D D, LEBARON M J, et al. A comparison of transgenic rodent mutation and in vivo comet assay responses for 91 chemicals[J]. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen, 2019, 839: 21-35.
[22] LUAN Y, XING G Z, QI X M, et al. The application of hepatic P450 reductase null gpt delta mice in studying the role of hepatic P450 ingenotoxic carcinogen 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone
induced mutagenesis[J]. Arch Toxicol, 2012, 86(11): 1753-1761.
[23] NISHIMURA J, MURAKAMI Y, KINOSHITA T. Paroxysmal nocturnal
hemoglobinuria: an acquired genetic disease[J]. Am J Hematol, 1999, 62
(3): 175-182.
[24] DERTINGER S D, PHONETHEPSWATH S, WELLER P, et al. Interlaboratory pig-a gene mutation assay trial: studies of 1, 3-propanesultone with immunomagnetic enrichment of mutant erythrocytes[J].Environ Mol Mutagen, 2011, 52(9): 748-755.
[25] 李若婉, 周長慧, 黃鵬程, 等. 基于TK6細胞的體外PIG-A基因突變檢測方法的建立[J]. 癌變·畸變·突變, 2019, 31(3): 242-248.
[26] BEMIS J C, HEFLICH R H. In vitro mammalian cell mutation assays
based on the pig-a gene: a report of the 7th international workshop on
genotoxicity testing (IWGT) workgroup[J]. Mutat Res Genet Toxicol
Environ Mutagen, 2019, 847: 403028.
[27] SCHMITT M W, KENNEDY S R, SALK J J, et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(36): 14508-14513.
[28] HOANG M L, KINDE I, TOMASETTI C, et al. Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal human tissues using massively parallel sequencing[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 11(35): 9846-9851.
[29] ABASCAL F, HARVEY L M R, MITCHELL E, et al. Somatic mutation
landscapes at single-molecule resolution[J]. Nature, 2021, 593(7859):
405-410.
[30] YOU X Y, THIRUPPATHI S, LIU W Y, et al. Detection of genome-wide low-frequency mutations with Paired-End and Complementary Consensus Sequencing (PECC-Seq) revealed endrepair-derived artifacts as residual errors[J]. Arch Toxicol, 2020, 94(10): 3475-3485.
來源：中國知網
