您當(dāng)前的位置：檢測(cè)資訊 > 科研開(kāi)發(fā)
嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2022-03-06 00:08
在結(jié)構(gòu)研究和體外生物化學(xué)分析等很多實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中都需要用到純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以從組織中獲取，亦或更經(jīng)常的是從模式生物中過(guò)量表達(dá)獲得，如細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等。蛋白質(zhì)純化主要是根據(jù)它們各不相同的物理性質(zhì)來(lái)從原料進(jìn)行分離，其目的就是希望能浪費(fèi)最少的雜蛋白，獲得最多的功能蛋白質(zhì)。一個(gè)好的蛋白質(zhì)的純化過(guò)程必須要將其純化工藝步驟優(yōu)化至最少。
蛋白質(zhì)純化工藝的建立
建立蛋白質(zhì)純化工藝時(shí)，最重要的是需要考慮純化得到的蛋白質(zhì)應(yīng)能滿(mǎn)足其后續(xù)應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)的數(shù)量及純度都必須滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)分析要求。而且，因?yàn)楹罄m(xù)研究需要的是保持良好折疊結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)行為的相關(guān)信息也需要考慮。在純化及后續(xù)的保存過(guò)程中，很多處理方法都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如蛋白質(zhì)的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細(xì)計(jì)劃，在最短時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)純化，并在最穩(wěn)定的條件下進(jìn)行保存才算是成功地完成了其整個(gè)純化過(guò)程。
緩沖液體系
每一步純化過(guò)程中，蛋白質(zhì)的溶液環(huán)境對(duì)其穩(wěn)定性和活性的保持都非常關(guān)鍵。蛋白質(zhì)應(yīng)該保存在一個(gè)良好的緩沖液環(huán)境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對(duì)蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)、溶解性和活性造成不可逆的影響。
緩沖液是一種含有共軛酸/堿對(duì)的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據(jù)其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結(jié)構(gòu)，50%為堿式結(jié)構(gòu)時(shí)的pH值 （圖1）。
圖 1. 含Tris堿及其酸式物的Tris緩沖液溶液
Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當(dāng)pH=8.06，50%的Tris是質(zhì)子化（酸式結(jié)構(gòu)），50%是去質(zhì)子化（堿式結(jié)構(gòu)）。
關(guān)于緩沖液的一個(gè)常規(guī)原則是，其pH值應(yīng)保證在pKa值左右1個(gè)pH值單位范圍內(nèi)，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時(shí)有足夠的以酸式結(jié)構(gòu)和堿式結(jié)構(gòu)存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時(shí)可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。
一種好的緩沖液必須具有以下特征 :
1、水溶性
2、化學(xué)穩(wěn)定性
3、在所需pH范圍內(nèi)良好的緩沖能力
4、與分析和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件具有良好的兼容性
5、與其他溶質(zhì)具有良好的兼容性
很多物質(zhì)都可以用于生物緩沖液。最常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種最常用的生物緩沖液、各自的pH值應(yīng)用范圍及各自可能對(duì)蛋白質(zhì)純化過(guò)程產(chǎn)生影響的優(yōu)缺點(diǎn)。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。
|
緩沖液 |
pH范圍 |
優(yōu)缺點(diǎn) |
|
磷酸緩沖液 |
5.8-8.0 |
|
|
MOPS緩沖液 |
6.5-7.9 |
|
|
HEPES緩沖液 |
6.8-8.2 |
|
|
Tris緩沖液 |
7.5-9.0 |
|
表一：蛋白質(zhì)純化中最常用的生物緩沖液
緩沖液在一定pH值范圍內(nèi)可保持它們的緩沖能力，部分緩沖液成分會(huì)對(duì)某些層析過(guò)程或者分析實(shí)驗(yàn)造成影響。
溶液添加劑
除了一個(gè)合適的緩沖液體系，蛋白質(zhì)純化過(guò)程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對(duì)蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性和活性方面均具有一定作用的成分。
溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會(huì)添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因?yàn)榇藭r(shí)幾乎所有的蛋白酶都已經(jīng)從目標(biāo)蛋白質(zhì)分離出去。蛋白質(zhì)的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結(jié)合以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)不被破壞和增強(qiáng)其溶解性。
|
類(lèi)型 |
功能 |
常用試劑 |
|
還原劑 |
防止氧化 |
|
|
蛋白酶抑制劑 |
防止內(nèi)源性蛋白酶分解蛋白 |
|
|
金屬螯合劑 |
使金屬蛋白酶失活 |
|
|
精氨酸激酶 |
穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)溶解性 |
|
|
離子穩(wěn)定劑 |
增強(qiáng)溶解性 |
鹽類(lèi) （如NaCl、KCl、（NH4）2SO4 |
表二：蛋白質(zhì)純化中用于增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常用添加劑。
添加劑只在必要時(shí)才使用?？赡苄枰啻螄L試才能確定某些添加劑是否對(duì)一些特定蛋白質(zhì)的純化工藝有效。
其他因素
蛋白質(zhì)純化工藝中的其他因素也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。對(duì)蛋白質(zhì)的處理步驟越少越好，在最短時(shí)間內(nèi)采用最少步驟的純化工藝才能保證得到最高產(chǎn)率的活性蛋白質(zhì)。而且，在整個(gè)純化過(guò)程中，蛋白質(zhì)最好都保持在低溫狀態(tài)。一般純化過(guò)程都在4°C進(jìn)行,因?yàn)檫@個(gè)溫度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情況下），又可以保證蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。
表達(dá)體系對(duì)蛋白純化的影響
開(kāi)始純化蛋白前應(yīng)先制備初始樣品。真正進(jìn)行蛋白純化的操作之前，首要考慮是目的蛋白的來(lái)源。樣品來(lái)源可為原始樣品，例如肝臟，肌肉或腦組織。雖然后基因組學(xué)領(lǐng)域的研究者很少使用原始組織純化蛋白，但當(dāng)研究者想要關(guān)聯(lián)某一蛋白序列的催化活性時(shí)，會(huì)有這樣的需求。
當(dāng)前，更為常見(jiàn)的是從重組來(lái)源的樣品純化蛋白質(zhì)。一些重要決定需要提前考慮以便優(yōu)化后續(xù)的純化。研究者需要考慮蛋白質(zhì)的最終用途（例如酶測(cè)定，結(jié)構(gòu)研究，抗體生成），因?yàn)檫@將決定最終蛋白質(zhì)制備所需的量和純度。盡管蛋白質(zhì)表達(dá)的詳細(xì)討論超出本文范圍，但是在這一點(diǎn)上仍有幾個(gè)值得考慮的基本點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懞罄m(xù)的蛋白純化。
哪個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)水平最高？一般規(guī)則是，表達(dá)水平越高，越容易獲得大量高度純化蛋白。如果選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，最終目的可溶性表達(dá)或不可溶表達(dá)是包涵體形式嗎？由于包涵體中有高豐度的重組蛋白，包涵體的分離本身構(gòu)成了純化的重要步驟; 這必須與溶解難易和隨后包涵體中再折疊靶蛋白的難易以及可溶性蛋白的最終產(chǎn)量相平衡。已經(jīng)有許多工作優(yōu)化了從包涵體中產(chǎn)生功能蛋白的產(chǎn)量。
另一個(gè)考慮是是否靶向胞內(nèi)或胞外（分泌的）表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)需要將蛋白質(zhì)從大量宿主細(xì)胞蛋白中純化而來(lái)。相比之下，特別是當(dāng)宿主細(xì)胞在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)時(shí)，目標(biāo)蛋白的有效分泌要求蛋白必須從少量分泌的宿主蛋白中純化而來(lái)。
初始樣品制備
無(wú)論目標(biāo)蛋白的來(lái)源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的制備很重要。同時(shí)也需要考慮表達(dá)和純化策略。
目標(biāo)蛋白的胞外分泌可使用簡(jiǎn)單快速親和純化方案；所需的唯一樣品制備可能需要傾倒貼壁細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或者低速離心以去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)然，制備過(guò)程的第一步色譜層析時(shí)可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調(diào)節(jié)pH，但這些步驟簡(jiǎn)單易行。然而，如果第一步純化樣品步驟進(jìn)行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽。當(dāng)處理大量條件培養(yǎng)基時(shí)可能會(huì)有技術(shù)難度；根據(jù)培養(yǎng)基的脫鹽體積?？刹捎猛肝龌蝈e(cuò)流過(guò)濾。
如果靶蛋白在胞內(nèi)表達(dá)，則細(xì)胞首先需要通過(guò)離心獲取，然后用合適的裂解緩沖液重懸。如上所述，裂解緩沖液需要包含合適的緩沖液和其它添加劑以確保靶蛋白的最大穩(wěn)定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時(shí)的緩沖液交換步驟，則樣品/裂解緩沖液的組成也需與隨后的純化步驟相適宜。
接下來(lái)，需要有效的細(xì)胞裂解方法。大腸桿菌可以通過(guò)弗氏壓碎器裂解（盡管這種方法不容易規(guī)?；?，超聲或基于洗滌劑的裂解（有很多商業(yè)裂解試劑）。通過(guò)向裂解緩沖液中加入溶菌酶可以改善基于洗滌劑的裂解效率。基于洗滌劑的裂解非常溫和，且不導(dǎo)致細(xì)菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產(chǎn)生具有良好流動(dòng)特性的樣品，通常需要加入含DNA酶（高純度制劑可商購(gòu)）。
哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞也可以通過(guò)超聲或基于洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要DNA酶處理降低樣品粘度。
一旦細(xì)胞（微生物/昆蟲(chóng)/哺乳動(dòng)物）被裂解，通常需要離心除去細(xì)胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，以避免色譜柱堵塞）。所得上清液即可開(kāi)始用于靶蛋白的柱色譜層析純化。
柱層析設(shè)備
柱層析的基本原理是將一份蛋白質(zhì)混合物分成很多小份，從而使某些組分中目標(biāo)蛋白的濃度通過(guò)濃縮得以增大。雖然已經(jīng)有很多昂貴和特殊的設(shè)備可用于柱層析，但實(shí)際上它只需要最基本的設(shè)備即可。
基本柱層析設(shè)備
1、固定相：一種惰性介質(zhì), 通常帶有一種可促進(jìn)蛋白質(zhì)相互作用的官能團(tuán)以進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。固定相和官能團(tuán)的選擇取決于層析色譜和方法的種類(lèi)。
2、柱子：一種圓柱形玻璃容器，長(zhǎng)度和直徑各不相同。柱子可以直接購(gòu)買(mǎi)已填裝固定相能直接連接到層析設(shè)備上使用的預(yù)裝柱，或可購(gòu)買(mǎi)空柱自己手動(dòng)填裝。自動(dòng)層析設(shè)備和人工重力柱使用的是不種類(lèi)型的柱子。
3、溶劑：含有添加劑的緩沖液，作為將蛋白質(zhì)在固定相上平衡和洗脫的流動(dòng)相。不同類(lèi)型的柱層析需要不同的溶液條件。
4、收集管：用于收集洗脫液樣品的容器。自動(dòng)組分收集器需要特定的收集管。手動(dòng)收集時(shí)，則試管或容器均可使用。
5、純度檢測(cè)方法：一種檢測(cè)樣品里所有蛋白質(zhì)中目標(biāo)蛋白相對(duì)含量的檢測(cè)手段。每一步獲得的含有目標(biāo)蛋白的組分都必須在進(jìn)行下一步純化工作前進(jìn)行檢測(cè)。后面的章節(jié)將對(duì)一些常用的純度分析方法進(jìn)行討論。
層析系統(tǒng)
柱層析可以依賴(lài)用泵將溶劑以固定流速打入填裝好的層析柱的自動(dòng)設(shè)備來(lái)完成或者依靠流動(dòng)相的重力作用自己完成。自動(dòng)系統(tǒng)或者重力柱系統(tǒng)均可與自動(dòng)組分收集器連接使用。
|
系統(tǒng)類(lèi)型 |
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
|
自動(dòng) |
|
需要配套特定、昂貴的設(shè)備 最大流速受層析柱壓力限限制 |
|
重力流 |
|
更依賴(lài)人工 流速受重力作用限制 |
表三：蛋白質(zhì)分離柱層析系統(tǒng)
親和層析
親和層析主要依靠蛋白質(zhì)與介質(zhì)配體間特異性的可逆結(jié)合作用進(jìn)行分離。配體可直接與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽結(jié)合。親和層析通常是一種最粗放的純化過(guò)程，一般在純化工藝的前期應(yīng)用?；诤罄m(xù)應(yīng)用的要求，可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質(zhì)。
親和層析的固定相是一種共價(jià)結(jié)合特異性配體的惰性介質(zhì)，該配體可與一個(gè)蛋白質(zhì)或一類(lèi)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。惰性介質(zhì)通常是交聯(lián)的瓊脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白質(zhì)可采用選擇性或非選擇性模式來(lái)進(jìn)行親和柱層析純化。在選擇性親和柱層析中，一般使用對(duì)蛋白質(zhì)有特異性作用的配體或共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽。在非選擇性親和柱層析中，如用于免疫球蛋白純化的蛋白A、G、L，用于DNA結(jié)合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，這些配體與一類(lèi)蛋白都具有相似的結(jié)合能力。
圖 4. 用蛋白A、G、L進(jìn)行親和層析的原理示意圖：A.抗體含有多個(gè)功能區(qū)：一類(lèi)蛋白質(zhì)的Fc區(qū)（片段，恒定區(qū)） 都是相同的，F(xiàn)v區(qū)（片段，可變區(qū)）是每個(gè)抗體各不相同的特異區(qū)，F(xiàn)ab（片段，抗原區(qū)）是抗體實(shí)際與特異性抗原結(jié)合的區(qū)域。B.抗體的特異性區(qū)域可以通過(guò)親和色譜進(jìn)行非選擇性純化，在該過(guò)程中，配體 （蛋白 A、G、L）是結(jié)合在分離介質(zhì)上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于純化特異性蛋白。這種情況下，抗體作為中間配體為其抗原提供選擇性。
兩類(lèi)親和色譜中，在不影響蛋白質(zhì)（或標(biāo)簽） 和配體間作用力的條件下，蛋白質(zhì)均在柱上保留。在不破壞特異性相互作用但可破壞所有雜蛋白與固定相間其非特異性作用的條件下，對(duì)所有結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行淋洗。最后用含有競(jìng)爭(zhēng)分子的緩沖液或者可破壞所有蛋白質(zhì)間相互作用的條件對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行洗脫。
競(jìng)爭(zhēng)分子可代替目標(biāo)蛋白與配體相結(jié)合。這種競(jìng)爭(zhēng)分子可通過(guò)其他層析手段或者透析的方式從目標(biāo)蛋白中去除。通過(guò)破壞所有蛋白間相互作用來(lái)從固定相洗脫蛋白的方法包括調(diào)節(jié)緩沖液的pH值或者離子強(qiáng)度。因?yàn)檫@些方法同樣會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，因此通常建議洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)要立即中和或者稀釋以將危害降到最小。有報(bào)道稱(chēng)，對(duì)于不同形式的親和層析，為獲得最高產(chǎn)率的活性蛋白需采用多種不同的流動(dòng)相條件 。
|
目標(biāo)蛋白 |
配體伴隨 |
洗脫 |
|
抗體（抗原特異性） |
抗原多肽 |
自由肽 |
|
多組氨酸標(biāo)記蛋白 |
Ni2+ or Co2+ |
咪唑或游離組氨酸 |
|
FLAG標(biāo)記蛋白質(zhì) |
FLAG特異性抗體 |
FLAG多肽或低pH值 |
|
GST標(biāo)記蛋白質(zhì) |
還原型谷胱甘肽 |
游離谷胱甘肽 |
|
Myc標(biāo)記蛋白質(zhì) |
Myc特異性抗體 |
低pH值 |
|
抗體（類(lèi)型特異性） |
蛋白A , G, or L |
極端pH值 |
|
DNA結(jié)合蛋白質(zhì) |
肝素 |
高離子強(qiáng)度 |
表五：帶有特異性活性官能團(tuán)（配體）的選擇性和非選擇性親和層析示例及其典型洗脫條件。
總結(jié)自Thermo Fisher Pierce和GE。不同類(lèi)型層析柱的供應(yīng)商見(jiàn)下，由來(lái)邦網(wǎng)（Labome）基于200余篇文獻(xiàn)調(diào)研給出。
設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，即可在其N(xiāo)端或C端（或在少數(shù)情況下，在結(jié)構(gòu)已知蛋白質(zhì)的柔性環(huán)狀區(qū)域） 引入親和標(biāo)簽以助于純化。
抗體通常是基于抗體與其抗原 （抗體識(shí)別的序列） 間的高特異性相互作用來(lái)進(jìn)行純化。一個(gè)含有抗原的多肽可以與帶有抗體特異結(jié)合位點(diǎn)的介質(zhì)相結(jié)合。降低流動(dòng)相緩沖液的pH值可破壞抗體/多肽間相互作用力，釋放出結(jié)合抗體。商業(yè)上，該方法常用于血清原液中抗體的純化。
蛋白質(zhì)同樣可通過(guò)非選擇性方式進(jìn)行親和純化。在非選擇性純化過(guò)程中，固定相上結(jié)合的配體可以與一類(lèi)具有類(lèi)似結(jié)合部位的蛋白質(zhì)相結(jié)合。DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的純化就是一個(gè)非選擇性親和層析的實(shí)例。因?yàn)楦嗡嘏cDNA的結(jié)構(gòu)和電荷極為類(lèi)似，它可以被作為DNA結(jié)合蛋白質(zhì)親和層析的配體。
由于所有的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)理論上都可以與該固定相結(jié)合，幾乎其他所有蛋白質(zhì)都會(huì)穿透而不與介質(zhì)結(jié)合，從而可達(dá)到目標(biāo)蛋白產(chǎn)率最大程度的富集。另一個(gè)例子是抗體通過(guò)其恒定區(qū) （Fc）與配體間的相互作用進(jìn)行富集濃縮，蛋白A、G、L都是常用的配體。GE Healthcare的蛋白A親和層析柱 [15-17] 和蛋白G [18] 都是常用的選擇。
當(dāng)采用類(lèi)似的結(jié)合模式（抗體與蛋白A、 G或 L配體結(jié)合）時(shí)，抗體的抗原結(jié)合區(qū)（Fab）仍然保持與其特異性抗原結(jié)合的能力。因此，特異性蛋白可通過(guò)配體/抗體結(jié)合和抗體的抗原間的特異性相互作用來(lái)純化。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方式見(jiàn)表6。
|
問(wèn)題 |
原因 |
解決方法 |
|
蛋白不結(jié)合 |
標(biāo)簽未翻譯或不可及 |
檢查質(zhì)粒序列或?qū)?biāo)簽移到其他位置 |
|
結(jié)合條件不合適 |
調(diào)節(jié)緩沖液條件 |
|
|
結(jié)合時(shí)間不夠 |
降低流速或停止過(guò)柱以延長(zhǎng)結(jié)合時(shí)間 |
|
|
蛋白未洗脫出 |
配體與標(biāo)簽間相互作用過(guò)強(qiáng) |
增大（特異性） 競(jìng)爭(zhēng)分子濃度或調(diào)節(jié)條件更嚴(yán)格（非特異性） |
|
蛋白質(zhì)柱上聚集 |
調(diào)整緩沖液到更利于保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件 |
|
|
低分辨率 |
流速過(guò)慢或過(guò)快 |
調(diào)整流速 |
|
柱子未充分洗脫 |
用條件更嚴(yán)格的緩沖液淋洗；根據(jù)廠家指導(dǎo)清洗固定相 |
|
|
蛋白質(zhì)柱上聚集 |
調(diào)整緩沖液到更利于保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件 |
|
|
洗脫條件不夠嚴(yán)格 |
增大（特異性） 競(jìng)爭(zhēng)分子濃度，或調(diào)節(jié)條件（非特異性） |
|
|
純化過(guò)程中蛋白質(zhì)失活 |
蛋白質(zhì)去折疊或聚集 |
調(diào)整緩沖液到更利于保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件 |
|
保持活性必要的輔因子在純化過(guò)程中被除去 |
添加輔因子 |
離子交換層析
離子交換層析分離蛋白的原理是基于其凈電荷的不同，通過(guò)蛋白質(zhì)與帶電荷的固定相之間的靜電作用力進(jìn)行分離。
IEX有以下兩類(lèi):
（1）陰離子交換層析 （固定相帶正電荷，與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）；
（2）陽(yáng)離子交換層析（固定相帶負(fù)電，與帶正電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）。離子交換層析常用于蛋白質(zhì)純化工藝中期。但是，對(duì)某些蛋白，在純化工藝的前期或后期采用該方法亦可獲得良好的分離效果。
圖 5. 蛋白質(zhì)凈電荷受其溶劑pH值影響。
當(dāng)pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)凈電荷為0，因此既不與陰離子交換的固定相也不與陽(yáng)離子交換的固定相相結(jié)合。調(diào)節(jié)pH值高于或低于pI值可使蛋白質(zhì)帶上凈電荷，使其與陰離子交換樹(shù)脂（pH > pI）的固定相或者陽(yáng)離子交換（pH < pI）的固定相相結(jié)合。
由于氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和與其共價(jià)結(jié)合的修飾成分的影響，所有的蛋白質(zhì)都會(huì)帶有凈電荷。由于溶劑可以與蛋白質(zhì)相互交換氫離子，因此蛋白質(zhì)的凈電荷受其溶劑pH值的影響。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）是蛋白質(zhì)不帶電時(shí)的pH值。當(dāng)pH值高于pI時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)帶負(fù)電，而當(dāng)pH值低于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)控制結(jié)合蛋白是與離子交換柱結(jié)合或是從柱上洗脫。
理論上來(lái)說(shuō)，只要緩沖液pH值調(diào)節(jié)合適，所有的蛋白質(zhì)都可以與陽(yáng)離子交換柱和陰離子交換柱結(jié)合。但是，蛋白質(zhì)純化過(guò)程中，選擇純化條件和層析柱類(lèi)型時(shí)最重要的考慮因素就是要保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。因此，選擇哪一種離子交換層析和選擇什么樣的條件會(huì)影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性是必須要考量的。通常，一些與某類(lèi)離子交換層析相結(jié)合的條件可能對(duì)某種蛋白質(zhì)比對(duì)其他蛋白質(zhì)更為合適。
了解蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的知識(shí)可幫助尋找最合適的離子交換層析方法。以下在線(xiàn)工具可計(jì)算一個(gè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn) EXPASY。這些計(jì)算都完全基于蛋白質(zhì)的氨基酸序列，不考慮其三維空間結(jié)構(gòu)。而在實(shí)際情況中，一個(gè)蛋白質(zhì)的某些殘基可能暴露得比其他部分更多，所以，其實(shí)際pI和表面凈電荷某些時(shí)候可能與理論計(jì)算值不盡相符 。氨基酸的相對(duì)位置分布同樣會(huì)影響一個(gè)蛋白質(zhì)的pI值 ，而這一點(diǎn)在理論計(jì)算時(shí)同樣未予考慮。有些技術(shù)可通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得蛋白質(zhì)實(shí)際的pI值，如等電聚焦電泳 、等電聚焦毛細(xì)管電泳 和高通量光學(xué)測(cè)量法等 。
蛋白質(zhì)與IEX的結(jié)合必須采用較寬pH值范圍的溶液進(jìn)行多次嘗試以獲得最合適的蛋白質(zhì)保留pH值。在pI值左右1個(gè)pH單位的溶液pH值通常認(rèn)為是較合適的蛋白質(zhì)結(jié)合pH值。但是，在有些情況下，也可能需要在遠(yuǎn)離pI值的pH值條件下進(jìn)行 。
圖 6. 離子交換層析。
蛋白質(zhì)在低離子強(qiáng)度條件下與帶電的固定相相結(jié)合。結(jié)合的蛋白質(zhì)可以通過(guò)增加緩沖液的離子強(qiáng)度或者調(diào)節(jié)其pH值進(jìn)行洗脫。
IEX的固定相是由惰性瓊脂糖或者高分子基質(zhì)與帶電基團(tuán)共價(jià)結(jié)合組成。介質(zhì)微粒有很多尺寸，可以無(wú)孔，也可以有多種不同尺寸的孔。介質(zhì)的選擇主要根據(jù)所需的結(jié)合能力、分辨率和流速要求來(lái)決定。介質(zhì)顆粒尺寸越小，分辨率越高，但相應(yīng)的流速也越低，分離時(shí)間也更長(zhǎng)。多孔介質(zhì)比無(wú)孔介質(zhì)的結(jié)合能力更強(qiáng)。無(wú)孔介質(zhì)中，蛋白質(zhì)不能進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)部，因此相比多孔介質(zhì)，前者的樣品回收率更高，分辨率更高，分離時(shí)間也更短。一個(gè)研究表明，對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)，采用無(wú)孔介質(zhì)和多孔介質(zhì)的分辨率和回收率都類(lèi)似，但對(duì)于尺寸較大的蛋白質(zhì)，多孔介質(zhì)由于體積排阻效應(yīng)而在分辨率上有一定損失。
IEX中最常用的4種帶電官能團(tuán)如下所示。它們根據(jù)離子交換能力的強(qiáng)弱分類(lèi)，強(qiáng)離子交換基團(tuán)可離子化的pH范圍比弱離子交換基團(tuán)的范圍更大。
陰離子交換 （固定相帶正電）:
1、季銨（Q） - 強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)
2、二乙氨乙基（DEAE） -弱陰離子交換基團(tuán)
陽(yáng)離子交換 （固定相帶負(fù)電）:
1、磺酸甲酯（S） -強(qiáng)陽(yáng)離子交換基團(tuán)
2、羧甲基（CM） - 弱陽(yáng)離子交換基團(tuán)
因?yàn)閺?qiáng)離子交換基團(tuán)的活性基團(tuán)在很大的pH范圍內(nèi)均可保持帶電，它可以在蛋白質(zhì)結(jié)合所需pH值是特別強(qiáng)的酸性或堿性的情況下使用（假設(shè)該pH值下蛋白質(zhì)穩(wěn)定性仍得以保持）。有些蛋白質(zhì)在弱離子交換上的保留較弱，使得它們可以用較低的離子強(qiáng)度洗脫 。由于高離子強(qiáng)度會(huì)影響部分蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而弱離子交換不需要在極端的pH值條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此可能對(duì)蛋白質(zhì)更合適。
離子交換色譜的固定相首先用低離子強(qiáng)度的緩沖液平衡，然后將蛋白質(zhì)樣品用和平衡過(guò)程相同離子強(qiáng)度的緩沖液上樣到固定相。結(jié)合的蛋白質(zhì)在用更高離子強(qiáng)度或pH值不同（圖6）的緩沖液洗脫前先淋洗一段時(shí)間。洗脫緩沖液中的抗衡離子與帶電的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白質(zhì)。在離子交換層析中，某些鹽類(lèi)代替結(jié)合蛋白和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能力，可能比其他種類(lèi)的鹽可能更有效 。
NaCl或KCl是洗脫液中最常用的鹽類(lèi)，其中Na+或K+是陽(yáng)離子交換層析中的抗衡離子，Cl-是陰離子交換層析中的抗衡離子。另一方面，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液的pH值來(lái)減少蛋白質(zhì)的電荷并破壞其與固定相之間的相互作用。對(duì)于結(jié)合到陽(yáng)離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，增加緩沖液pH值會(huì)使蛋白質(zhì)所帶正電荷減少，因此可將其從柱上洗脫下來(lái)。對(duì)于結(jié)合到陰離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，降低pH值可減少蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷將其從柱上洗脫下來(lái)。
同時(shí)，還可以調(diào)節(jié)緩沖液的pH值使目標(biāo)蛋白質(zhì)不與離子交換固定相相結(jié)合，而與此同時(shí)雜蛋白與固定相結(jié)合。如此，可在穿透液中收集目標(biāo)蛋白質(zhì)，而雜蛋白通過(guò)與固定相結(jié)合得以去除。
與其他層析方法相比，離子交換層析在確定蛋白質(zhì)結(jié)合、洗脫和獲得足夠高的分辨率的最佳條件時(shí)可能需要解決更多的問(wèn)題。
疏水層析
疏水作用層析（HIC）分離蛋白質(zhì)主要是基于它們疏水性的不同。它常在蛋白質(zhì)純化工藝的中期使用。在HIC中，蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的緩沖液中與固定相結(jié)合，因此，無(wú)需更換緩沖液或者洗脫液即可在離子交換色譜之后直接應(yīng)用HIC。同樣，HIC也可以跟在通過(guò)用鹽類(lèi)沉淀快速去除部分而非全部蛋白質(zhì)的硫酸銨沉淀步驟之后實(shí)施。HIC有時(shí)在純化工藝的前期使用，有時(shí)也作為最后一個(gè)步驟來(lái)去除目標(biāo)蛋白中的微量雜質(zhì)。
溶液中存在的鹽離子可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的部分去折疊，暴露出部分常規(guī)情況下隱藏于內(nèi)部的疏水殘基。當(dāng)加入離子強(qiáng)度較低的緩沖液時(shí)，結(jié)合到固定相的蛋白質(zhì)恢復(fù)到原折疊結(jié)構(gòu)。由此，可減少其可與固定相相互作用的疏水殘基的暴露，有利于蛋白質(zhì)從固定相上洗脫下來(lái)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可以隨著離子強(qiáng)度的降低而自動(dòng)地再折疊回原結(jié)構(gòu)，所以HIC是一種非常有價(jià)值的一種蛋白質(zhì)純化手段。
圖 8. 逐漸降低鹽（硫酸銨）濃度梯度從疏水柱上洗脫下的蛋白質(zhì)。
收集的組分需進(jìn)行蛋白濃度和目標(biāo)蛋白特異性活性的檢測(cè)。根據(jù)蛋白質(zhì)活性檢測(cè)結(jié)果，目標(biāo)蛋白的濃度在第45組組分中達(dá)到最高。
離子強(qiáng)度應(yīng)該盡量低，使其可以促使目標(biāo)蛋白結(jié)合，同時(shí)又不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。如果結(jié)合所需離子強(qiáng)度高到導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的沉淀，可以使用略低的離子強(qiáng)度。這種情況下，層析過(guò)程可以將所有結(jié)合蛋白質(zhì)與穿透的未結(jié)合目標(biāo)蛋白分離開(kāi)。
在層析柱上樣前，固定相必須用高離子強(qiáng)度的緩沖鹽平衡（蛋白質(zhì)樣品所使用的相同的緩沖液），然后柱上上樣，并淋洗一段時(shí)間后，再用較低離子強(qiáng)度的緩沖液將蛋白質(zhì)洗脫（圖 7、8）。
圖 7. 疏水作用層析。
在高離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)部分去溶劑化，使其通常隱藏在內(nèi)部的疏水部分更多地暴露出來(lái)。這些殘基會(huì)與介質(zhì)上的疏水官能團(tuán)發(fā)生疏水相互作用。降低離子強(qiáng)度可以使蛋白質(zhì)重新隱藏其疏水部分，折疊回復(fù)原結(jié)構(gòu)。這會(huì)降低蛋白質(zhì)與固定相之間的疏水相互作用，完成蛋白質(zhì)的洗脫。
疏水作用層析的固定相是由交聯(lián)的瓊脂糖或合成的共聚高分子的骨架組成。骨架上共價(jià)連接上烷基或者芳香基的配體，以便與疏水性分子產(chǎn)生特異性相互作用。
官能團(tuán)的種類(lèi)包括：
1、烷基 - 不同長(zhǎng)度的碳?xì)滏溄Y(jié)構(gòu)，通常為丁基或者辛基。固定相的結(jié)合能力隨著烷基鏈的增長(zhǎng)而增加 [31] 。官能團(tuán)結(jié)合蛋白的能力主要是基于蛋白質(zhì)的疏水性
2、芳香基 - 一種由芳環(huán)衍生而來(lái)的官能團(tuán)，通常為芐基。芳香基的特異性通常更高，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)還可以通過(guò)基本的堆積作用與該官能團(tuán)相互作用。
每一種蛋白的結(jié)合和洗脫緩沖液所用鹽的種類(lèi)和濃度都應(yīng)經(jīng)由實(shí)際實(shí)驗(yàn)確定。此外，蛋白質(zhì)的再折疊和活性在洗脫后都必須得到保證。
和其他柱層析類(lèi)似，優(yōu)化HIC工藝時(shí)也需要解決大量的問(wèn)題。每一種蛋白都需要調(diào)節(jié)緩沖液條件和固定相以保證獲得最優(yōu)化的分離。
凝膠過(guò)濾層析
凝膠過(guò)濾又稱(chēng)為分子篩及體積排阻，體積排阻層析是根據(jù)蛋白質(zhì)具有不同的水力學(xué)半徑將它們進(jìn)行分離，該數(shù)據(jù)主要通過(guò)測(cè)量分子尺寸和形狀兩方面信息獲得。與上述其他層析過(guò)程不同的是，蛋白質(zhì)不與SEC的固定相相結(jié)合，而是依靠它們通過(guò)惰性固定相的速度不同來(lái)完成分離。
圖 9. 三種不同水力學(xué)半徑的蛋白質(zhì)混合物用體積排阻色譜柱分離。
大蛋白因?yàn)椴荒苓M(jìn)入介質(zhì)孔道內(nèi)部而只能直接流經(jīng)柱體最先流出。稍小的蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入介質(zhì)孔道內(nèi)部，流經(jīng)的路徑更復(fù)雜，因此需要更多的時(shí)間來(lái)穿過(guò)介質(zhì)并流出柱體
基于SEC可分辨不同種類(lèi)蛋白的能力，它通常是一種用于最后一步純化的有效方法。低聚物 、去折疊的蛋白分子和缺失蛋白都可以在逐漸置換緩沖液的過(guò)程中與結(jié)構(gòu)完整的天然蛋白質(zhì)分子分離開(kāi)。通常，由于SEC可使用溶劑種類(lèi)更多，所用的緩沖鹽也更少，因此比透析的緩沖液置換過(guò)程更快也更可靠。整個(gè)SEC過(guò)程都只使用一種溶劑，而市購(gòu)的SEC固定相幾乎與所有常規(guī)的緩沖液兼容。
固定相的類(lèi)型和柱子的長(zhǎng)度對(duì)蛋白質(zhì)的SEC分離的分辨率有很大的影響。市場(chǎng)上有很多種固定相可選，其選擇最好是根據(jù)待分離蛋白質(zhì)分子的分子量和分離條件兩方面來(lái)決定。
與其他層析方法一樣，SEC同樣既有優(yōu)點(diǎn)也有缺點(diǎn)。是否采用SEC要取決于蛋白質(zhì)本身及其后續(xù)應(yīng)用的要求。
SEC的優(yōu)點(diǎn)：
1、可進(jìn)行緩沖液交換和脫鹽。
2、可分離其他純化技術(shù)難以分離的相似品種（如蛋白片段和低聚物）。
3、可與多種溶劑相容。
4、不依賴(lài)于蛋白質(zhì)的任何一種特殊形式進(jìn)行保留和洗脫。
SEC的缺點(diǎn):
1、分離效果嚴(yán)重依賴(lài)柱子的填裝效果。
2、蛋白質(zhì)與介質(zhì)間有非特異性相互作用，會(huì)降低分辨率。
3、對(duì)復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物分辨率低。
4、為保證足夠的分辨率，上樣量必須較小。這對(duì)沉淀得到的高濃度蛋白質(zhì)是一個(gè)問(wèn)題。
要優(yōu)化SEC條件以獲得最好的分離效果，常常需要耗費(fèi)大量時(shí)間，而一些因素會(huì)對(duì)分離效果產(chǎn)生非常大的影響。
提高SEC分離效果的條件:
1、上樣體積盡量最小。上樣體積越小，洗脫組分的擴(kuò)散將會(huì)越弱。
2、緩沖液中加鹽。少量的鹽有助于防止蛋白質(zhì)與固定相間的非特異性相互作用。這將保證所有的蛋白質(zhì)可以穩(wěn)定地流過(guò)整個(gè)層析柱。
3、采用合適的流速。流速過(guò)快使得小分子沒(méi)有足夠的時(shí)間流經(jīng)介質(zhì)孔道，流速過(guò)慢則會(huì)導(dǎo)致樣品擴(kuò)散時(shí)間增加。
4、保證樣品和溶劑的黏度接近。調(diào)整樣品的條件使其與洗脫緩沖液的類(lèi)似。
5、調(diào)整層析柱長(zhǎng)度。柱子過(guò)短使蛋白質(zhì)分離不充分。而柱子過(guò)長(zhǎng)則使得蛋白質(zhì)樣品擴(kuò)散嚴(yán)重。
6、重裝柱子。柱子的填裝效果會(huì)蛋白質(zhì)的分離效果有相當(dāng)大的影響。
如果介質(zhì)顆粒沒(méi)有分布均勻或者填裝時(shí)帶入氣泡，蛋白質(zhì)將不能順利地流過(guò)固定相。此外，如果柱子跑干了，就必須重裝。柱子填裝不好通常就是分離效果不好的原因。
由于SEC并不是基于蛋白質(zhì)官能團(tuán)間的相互作用來(lái)進(jìn)行分離，所有的蛋白質(zhì)都在相同的條件下進(jìn)行洗脫，所以分離效果僅僅依賴(lài)于蛋白質(zhì)各自不同的水力學(xué)半徑。因此，SEC通常不適合在含有較多雜蛋白的純化工藝前期使用。但是，SEC又可作為一種快速可靠的樣品脫鹽或者小分子去除方法用于分離工藝前或中期。在純化的最后階段，當(dāng)只剩痕量雜蛋白時(shí)，SEC則是一種蛋白質(zhì)分離和置換保存緩沖液的有效方法。
蛋白質(zhì)洗脫方法
固定相上結(jié)合的蛋白質(zhì)要用可破壞結(jié)合作用力的溶劑條件進(jìn)行洗脫。這些流動(dòng)相的條件要根據(jù)層析類(lèi)型和目標(biāo)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來(lái)選擇。蛋白質(zhì)洗脫方法通常包括以下三種：批次洗脫，階梯式洗脫和線(xiàn)性梯度洗脫。如何選擇最好的方法要依靠采用的層析方式和所需的分離效果來(lái)決定。
1、批次洗脫 - 一步即將所有結(jié)合蛋白質(zhì)一次性洗脫?；谔禺愋韵嗷プ饔?（如親層析）的層析方法最好采用這種方式。批次洗脫法沒(méi)有任何分離效果，但它可以很好地快速去除雜質(zhì)。它需要事先了解取代目標(biāo)蛋白所需的緩沖液條件。
2、階梯式洗脫 - 連續(xù)進(jìn)行多步批次洗脫，并每次逐漸增強(qiáng)洗脫條件。在階梯式洗脫中，收集的組分?jǐn)?shù)取決于連續(xù)批次洗脫的次數(shù)。階梯式洗脫比批次洗脫的分離效果要好，但比線(xiàn)性梯度洗脫的效果要差。
3、線(xiàn)性梯度洗脫 - 當(dāng)流動(dòng)相以線(xiàn)性梯度洗脫時(shí)可收集多種連續(xù)流出的組分。對(duì)于離子交換層析和疏水作用層析，線(xiàn)性梯度洗脫可以獲得最好的分離效果，同時(shí)，它還可以收集到大量的連續(xù)組分。
由于體積排阻層析中蛋白質(zhì)和固定相之間不存在相互作用，因此不需要采用任何一種上述洗脫方法。蛋白質(zhì)上樣后，無(wú)需改變洗脫緩沖液的條件，即可連續(xù)不斷地收集各分離組分至所有蛋白質(zhì)全部被洗脫為止理想的情況是這根層析柱所采用的洗脫緩沖液同樣可用于后續(xù)的層析柱，由此可省去兩步之間必須的緩沖液置換或者透析操作。
其它色譜方法
羥基磷灰石（羥基磷酸鈣）是最初在20世紀(jì)50年代中期描述的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。球形羥基磷灰石的商業(yè)可得性使羥基磷灰石柱色譜法成為可及的技術(shù)。蛋白質(zhì)與羥基磷灰石柱相互作用的機(jī)制是復(fù)雜的。蛋白質(zhì)最常用磷酸鹽梯度洗脫。羥基磷灰石與其他色譜技術(shù)具有不同的選擇性，因此可以對(duì)有難度的蛋白純化或作為最終“拋光”步驟提供有效補(bǔ)充。羥磷灰石層析已經(jīng)成功地用于治療級(jí)抗體的純化。
色譜聚焦是一種基于其pI分離蛋白質(zhì)的柱層析法。蛋白質(zhì)結(jié)合到專(zhuān)門(mén)的離子交換介質(zhì)上并用pH梯度洗脫。色譜聚焦的選擇性不同于其他技術(shù)的選擇性，因此可用作最終的“拋光”步驟。
組分純度分析
每一次柱層析分離完成后，收集的組分必須進(jìn)行分析以檢測(cè)其所含的目標(biāo)蛋白及各組分的相對(duì)純度。每一步之后都需要進(jìn)行該類(lèi)分析以確定哪些組分可以被合并用于下一步。為檢測(cè)純度，必須有一種方法能檢測(cè)出某種特定蛋白質(zhì)相對(duì)所有蛋白質(zhì)的含量。下列即為一些常用于純度分析的方法:
1、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） - 一種基于蛋白質(zhì)尺寸不同來(lái)進(jìn)行分離的變性凝膠。市售染色劑可使樣品中所有蛋白質(zhì)顯色可見(jiàn)，可據(jù)此對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純度分析（圖10）。SDS-PAGE不能對(duì)組分進(jìn)行大規(guī)模的分析，并且需要耗費(fèi)數(shù)小時(shí)。但由于易操作、經(jīng)濟(jì)且適用于所有蛋白，因此它仍然是一種最常用采用的方法。
圖 10. 蛋白質(zhì)純化工藝中收集的蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。
2、光譜分析 - 一種分析蛋白質(zhì)光學(xué)性質(zhì)的方法。這種用于蛋白質(zhì)純度分析的方法只適用于如細(xì)胞色素P450等具有獨(dú)特光學(xué)特征的蛋白質(zhì)。這一類(lèi)蛋白質(zhì)在某特定波長(zhǎng)（420 nm附近 [40] ）有吸收而其他蛋白質(zhì)沒(méi)有，因此比較它在420nm和280nm處 （該波長(zhǎng)處所有蛋白質(zhì)均有吸收） 的吸收，即可獲得該蛋白質(zhì)的純度信息。這個(gè)方法快速且可大規(guī)模操作，但僅使用于部分蛋白質(zhì)。
3、蛋白質(zhì)測(cè)活 - 一種目標(biāo)蛋白的酶活實(shí)驗(yàn)。這種測(cè)定蛋白質(zhì)純度的方法通常與其他蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法相結(jié)合以計(jì)算其相對(duì)整體蛋白質(zhì)濃度的活性?；钚詼y(cè)試只適用于活性可以被高通量方法如酶解測(cè)活的蛋白質(zhì)。對(duì)某些蛋白質(zhì)而言，活性測(cè)試提供了一種快速可靠的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。酶的測(cè)活是非常有用的，因?yàn)檫@樣在下一步應(yīng)用前即可先將失活的蛋白質(zhì)排除出去。
純化后蛋白保存
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)純度已滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)研究的要求時(shí)，即可將其以合適的方式保存起來(lái)。最終保存用緩沖液的選擇和純化過(guò)程中選擇所用的緩沖液一樣重要，同樣依賴(lài)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和純化蛋白質(zhì)后續(xù)應(yīng)用所需條件來(lái)選擇。通常，因?yàn)樵赟EC層析過(guò)程中可以完成緩沖液的有效置換，因此它通常被安排為整個(gè)純化工藝的最后一步。純化的組分可以立即合并保存，或者最后合并的組分也可以透析為所選的緩沖液后再保存。
由于蛋白質(zhì)的保存條件取決于目標(biāo)蛋白本身，應(yīng)將其優(yōu)化至能長(zhǎng)期保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性的條件。在儲(chǔ)存條件下，保存緩沖液中通常會(huì)加入一些添加劑用于延長(zhǎng)純化蛋白的保存期。由于每種蛋白質(zhì)的表現(xiàn)各不相同，因此需要通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找最合適的保存條件。
膜蛋白
細(xì)胞產(chǎn)生的約20-30％的蛋白質(zhì)是整合膜蛋白，并且約50％的小分子藥物作用于膜蛋白質(zhì)。因此，針對(duì)解決膜蛋白結(jié)構(gòu)有極大的興趣。純化整合膜蛋白的關(guān)鍵步驟是它們從脂質(zhì)雙層的溶解，同時(shí)保留其功能完整性。典型的方法包括通過(guò)離心分離細(xì)胞內(nèi)膜，隨后洗滌劑溶解整合膜蛋白質(zhì)并高速離心以除去不溶性膜殘余物。
大量的洗滌劑已被用于膜蛋白溶解，并且在沒(méi)有文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室先例的情況下，研究者將需要憑經(jīng)驗(yàn)確定某特定蛋白質(zhì)的最佳洗滌劑。然后通過(guò)本質(zhì)上與可溶性蛋白相同的柱色譜法純化溶解的膜蛋白。然而，純化緩沖液將需包含洗滌劑以保持蛋白質(zhì)處于可溶狀態(tài)。膜蛋白的純化通常非常具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樵趶闹|(zhì)雙層初步移除和通過(guò)各種純化步驟后蛋白質(zhì)功能完整性和聚集的常常喪失。近來(lái)，納米盤(pán)已經(jīng)成功地用于B家族GPCR的親和純化。
無(wú)論是蛋白研究還是應(yīng)用，通常需要將蛋白利用不同的生物系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)，然后進(jìn)行分離和純化。研究實(shí)驗(yàn)室通常需要純化微克或毫克級(jí)別的蛋白質(zhì)，而工業(yè)上需要純化數(shù)千克甚至數(shù)噸的蛋白質(zhì)。因此，蛋白純化非常重要。純化過(guò)程中，主要需要考慮宿主污染、樣品的可溶性、蛋白結(jié)構(gòu)的完整性和生物活性。分享了以上蛋白純化的方法，希望對(duì)大家工作有所幫助。
來(lái)源：Internet
