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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-03-16 09:41
摘要
蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）技術是一種通過泛素 - 蛋白酶體途徑化學誘導靶蛋白降解的新興策略。PROTAC 是由靶蛋白配體和 E3 泛素連接酶配體通過適當?shù)倪B接鏈連接而成的雙功能分子，能夠同時招募靶蛋白和 E3 泛素連接酶，從而誘導靶蛋白泛素化降解，具有廣泛的應用前景和發(fā)展空間。主要簡述小分子 PROTAC 的降解機制、發(fā)展歷程，以及在藥物研發(fā)中面臨的機遇與挑戰(zhàn)。
自然界已進化出高效的酶系統(tǒng)來調(diào)控泛素化和隨后的蛋白質(zhì)降解。如果這些酶系統(tǒng)能夠被人為利用和重新靶向以達到疾病的治療目的，其潛力將是巨大的。蛋白降解靶向嵌合體（proteolytic targeting chimera，PROTAC）技術正是一種人為化學誘導靶蛋白（protein of interest，POI）多聚泛素化，最終通過蛋白酶體通路靶向降解 POI 的新興技術，為疾病的治療提供了新的策略。PROTAC 是由靶蛋白配體和 E3 泛素連接酶配體通過適當?shù)倪B接鏈組成的雙功能分子，能夠同時招募靶蛋白和 E3 泛素連接酶誘導靶蛋白泛素化降解，其獨特的作用模式具有廣泛的應用前景和發(fā)展空間，備受學術界和制藥工業(yè)界的關注，在克服耐藥性以及傳統(tǒng)“不可成藥”（undruggable）靶點方面有巨大的潛力，更是一種全新的藥物研發(fā)策略 [1]。
01、PROTAC 的降解機制及特點
通常，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬 / 溶酶體 2 條途徑進行降解 [2]。2004 年諾貝爾化學獎被授予 Ciechanover、Hershko 和 Rose 這 3 位科學家，以表彰他們在泛素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解方面的卓越貢獻， 此后泛素介導的蛋白降解機制被穩(wěn)步揭曉。蛋白質(zhì)泛素化是一種多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，影響著細胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、基因表達、信號傳遞等整個生命過程。泛素化過程可以簡單地概括為：泛素標簽首先與 E1 泛素激活酶結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移到 E2 泛素結(jié)合酶上，隨后依賴于一個大家族的銜接蛋白（E3 泛素連接酶）將其泛素傳遞到靶蛋白上。被泛素標記的蛋白質(zhì)被蛋白酶體特異性識別并降解 [3]。蛋白酶體是細胞內(nèi)的一種復合物，主要負責將特異性泛素化的蛋白質(zhì)降解 [4]（見圖 1）。
PROTAC 分子由靶蛋白配體、連接鏈和 E3 泛素連接酶配體 3 部分組成，是一種能特異性結(jié)合靶蛋白同時招募 E3 泛素連接酶并使 POI 多聚泛素化、最終通過蛋白酶體系統(tǒng)降解的雙功能分子 [5]。
PROTAC 分子泛素化標記 POI 并促使蛋白降解后可與 POI 解離并可在細胞內(nèi)循環(huán)利用，起到亞化學計量催化的效果，減少藥物的使用劑量從而減少體內(nèi)藥物暴露量，降低毒副作用 [6]（見圖 2）。
從作用模式來看，PROTAC 分子與傳統(tǒng)的抑制劑有著根本的區(qū)別。傳統(tǒng)的抑制劑是以占用驅(qū)動（occupancy-driven）的作用模式，特異性結(jié)合于靶蛋白的空腔內(nèi)。這種模式需要較高的藥物濃度， 以維持對靶蛋白的占用水平，進而發(fā)揮藥理活性， 獲得臨床應用價值 [7]。相反，PROTAC 是事件驅(qū)動（event-driven）的作用模式，其不受均衡占有率（equilibrium occupancy）的影響，在較低濃度就能夠?qū)崿F(xiàn)超 90% 的靶蛋白降解，這對占用驅(qū)動模式是難以實現(xiàn)的 [8]。
02、PROTAC 重要發(fā)展歷程
早在 2001 年， 耶魯大學 Craig M. Crews 教授團隊和加州理工大學的 Raymond J. Deshaies 教授首次提出 PROTAC 這一概念并經(jīng)過一系列的概念驗證（proof of concept）報道了首個 PROTAC 分子——Protac-1（1），其可靶向降解甲硫氨酰氨肽酶-2（MetAp-2）[9]。隨后繼續(xù)對其深入研究， 不斷擴大應用范圍并成功降解雌激素受體（ER）和雄激素受體（AR）[10]。
基于希佩爾·林道（Von Hippel Lindau，VHL）E3 泛素連接酶的多肽類 PROTAC 于 2004 年被首次報道 [11]。這些早期基于多肽類的 PROTAC 是源于轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導因子-1α（HIF-1α）衍生的肽序列構(gòu)建的，HIF-1α 被脯氨酰羥化酶羥化后能與 VHL 蛋白結(jié)合。隨后的大量研究工作發(fā)現(xiàn)了阻斷 HIF-1α 和VHL 相互作用的小分子抑制劑 [12]。X 射線衍射技術闡明了高效小分子抑制劑的結(jié)合模式。最初的 HIF-1α 衍生肽被含有羥脯氨酸結(jié)構(gòu)的小分子取代，得到了高親和力和高特異性 VHL 配體[12]。大量文獻研究表明，基于小分子的 VHL-PROTAC 能有效降解雌激素相關受體（ERRα）[6]、AR[13]、激酶 RIPK2 [6]、BCR-ABL 融合蛋白 [14-15]、含溴區(qū)結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（BRD）4 [16]、TBK1、跨膜酪氨酸激酶（EGFR、HER2 和 c-Met）[17]、MEK[18] 和 TRIM24 蛋白 [19]。
早期基于多肽的 PROTAC 在體外驗證以及作為生物化學分子工具具有一定的價值，然而由于細胞通透性、化學穩(wěn)定性以及成藥性方面的問題，其在體內(nèi)的進一步研究受到一定程度限制。因此，非肽類 PROTAC 在該領域的研發(fā)至關重要。
2008 年，耶魯大學 Craig M. Crews 教授團隊首次合成了含有 nutlins 的小分子 PROTAC，成功地將 AR 募集到鼠雙微體 2（mouse double minute 2，MDM2）上，并作為 E3 泛素連接酶觸發(fā)其泛素化和蛋白酶體降解 [20]。MDM2 是一種主要靶向腫瘤抑制因子 p53 的 E3 泛素連接酶 [21]。此外，Craig M.Crews 團隊的研究結(jié)果表明，以 idasanutlin 為 MDM2配體，JQ1 為 BRD4/BET 抑制劑組成的 MDM2 誘導BRD4 泛素降解的 A1874 化合物對靶蛋白 BRD4 的降解率為98%，在納摩爾水平表現(xiàn)出較好的生物活性[22]。值得注意的是，該 PROTAC 既能降解 BRD4 又能穩(wěn)定 p53，是關于 E3 泛素連接酶配體和靶蛋白配體的協(xié)同抗增殖作用的首次報道。2019 年 1 月，清華大學饒燏教授團隊基于 MDM2 的 E3 泛素連接酶設計并合成了具有靶向降解作用的多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP1）降解子 [23]。
2010 年，Ito 等 [24] 揭示了沙利度胺致畸作用的分子靶點和主要原因——Cereblon 蛋白（CRBN）。沙利度胺及其衍生物來那度胺和泊馬度胺作為免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）[25] 已被批準用于多發(fā)性骨髓瘤。在機制上，IMiD 靶向 E3 泛素連接酶 CUL4- RBX1-DDB1-CRBN（也被稱為 CUL4CRBN）。IMiD 與 CRBN 結(jié)合，使得 IKAROS 家族轉(zhuǎn)錄因子（IKZF1 和 IKZF3）被募集到 CRBN 上進而泛素化降解 [26]。2014 年，與沙利度胺和來那度胺結(jié)合的DDB1-CRBN 復合物晶體結(jié)構(gòu)得以解析 [27]，從此， 以 CRBN 為靶點的 IMiD 小分子和以各種蛋白質(zhì)為靶點的 PROTAC 迅猛發(fā)展。現(xiàn)已成功開發(fā)出靶向BRD2/3/4 [28]、FK506 結(jié)合蛋白 12（FKBP12）[29]、BCR-ABL 融合蛋白[30]、BRD9 [31]、沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sirt2）[32]、細胞周期蛋白依賴性激酶 9（CDK9）[33]、FMS 樣酪氨酸激酶 3（FLT3）[34]、布魯頓酪氨酸激酶（BTK）[35]、間變性淋巴瘤激酶（ALK）[36]、周期蛋白依賴性激酶 4/6（CDK4/6）[37] 和組蛋白去乙酰化酶 6（HDAC6）[38] 的小分子 PROTAC。
另一種 E3 泛素連接酶，細胞凋亡抑制蛋白 1（cIAP1）也被用于 PROTAC 的設計。2010 年，Hashimoto 課題組公開了由甲基貝他定（methyl bestatin，MeBS）和全反式視黃酸（ATRA）組成的 PROTAC，其中 MeBS 可選擇性地結(jié)合到 cIAP1 的 BIR3 結(jié)構(gòu)域（其 RING 結(jié)構(gòu)域促進自動泛素化），維甲酸受體內(nèi)源性配體 ATRA 能募集細胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白 CRABP-1 和 CRABP-2[39]。該項工作是首次基于 cIAP1 的 PROTAC 成功地誘導CRABP-1 和CRABP-2 靶蛋白泛素化蛋白酶體降解。通過用 MV1 配體（即 cIAP1/cIAP2/XIAP 配體）替換 MeBS，可進一步改進 PROTAC，實現(xiàn) cIAP1 和CRABP-2 這 2 種蛋白同時敲除 [40]。其他開發(fā)的該類 PROTAC 小分子還有 SNIPER（specific and non- genetic IAP-dependent protein eraser），該小分子可靶向降解 ERα [41]、BRD4[42]、轉(zhuǎn)錄相關酸性卷曲蛋白 3（TACC3）[43] 和 BCR-ABL 融合蛋白 [44]。
2017 年，Ciulli 教授領銜的科研團隊首次報道了 PROTAC 分別與 E3 泛素連接酶和靶蛋白受體形成的穩(wěn)定三元復合物共晶結(jié)構(gòu) [45]。實驗證明，PROTAC 分子是通過中間連接鏈適當?shù)卣郫B彎曲，讓其兩端分別深入兩受體疏水空腔內(nèi)部，拉近 E3 泛素連接酶與靶蛋白的距離，形成特異性的蛋白 - 蛋白相互作用，促進靶蛋白的泛素化。該研究為后續(xù)的理性 PROTAC 藥物分子設計奠定了基礎。PROTAC 發(fā)展歷程中的重要事件見圖 3。表 1 介紹了具有代表性的小分子 PROTAC（2 ~31）。
03、小分子 PROTAC 新藥研發(fā)面臨的機遇、挑戰(zhàn)及研究近況
PROTAC 技術問世至今已經(jīng)走過近 20 年的發(fā)展歷史，據(jù)不完全統(tǒng)計，現(xiàn)已有超過 30 個靶點可以被PROTAC 分子泛素化降解 [46]，展現(xiàn)出廣闊的疾病治療前景。自 2013 年起，Arvinas、C4 Therapeutics、Kymera Therapeutics 等專注于 PROTAC 分子開發(fā)的公司相繼成立，默克、基因泰克、輝瑞、諾華、勃林格殷格翰等制藥巨頭也紛紛布局這一技術領域。制藥工業(yè)界的加入必將給 PROTAC 帶來新的發(fā)展契機。2019 年 3 月，Arvinas 公司宣布其開發(fā)的首個用于治療前列腺癌的 AR 降解劑 ARV-110 進入Ⅰ期臨床試驗（NCT03888612）。2019 年 10 月 23 日，Arvinas 公司公布了 ARV-110 和 ARV-471 的Ⅰ期臨床試驗初始結(jié)果：口服 PROTAC 對腫瘤患者具有良好的安全性和耐受性。ARV-110 是公開報道的首個進入Ⅰ期臨床試驗的 PROTAC 分子，標志著PROTAC 技術的研究進入新的階段。鑒于 PROTAC 的分子特點及其獨特的作用機制，PROTAC 技術在新藥研發(fā)及疾病治療中面臨著諸多機遇與挑戰(zhàn) [47]。
3.1 PROTAC 的機遇
3.1.1 有望克服耐藥性
腫瘤耐藥已成為當前臨床治療面臨的主要挑戰(zhàn)。隨著新靶點和新型藥物發(fā)現(xiàn)技術不斷涌現(xiàn)，通過小分子藥物靶向致病蛋白或受體為腫瘤的治療提供了強有力的策略。特別是在過去的 20 年里激酶抑制劑領域蓬勃發(fā)展，在臨床應用中取得了驚人的效果，極大地改善了腫瘤患者的生活質(zhì)量，并延長其生存期 [48]。然而盡管靶向藥物的效果十分顯著，但患者在治療一段時間后往往會出現(xiàn)不同程度的耐藥，造成疾病復發(fā)。因此開發(fā)新技術克服腫瘤耐藥是抗腫瘤研究的熱點。
經(jīng)過近 20 年的發(fā)展，PROTAC 在克服腫瘤耐藥性方面已獲得顯著性進展 [49]。2018 年 Craig M. Crews 課題組研發(fā)的靶向 AR 的PROTAC 分子 ARCC-4（32） 可有效克服前列腺癌對恩扎魯胺的耐藥性（DC50 = 5 nmol · L-1，Dmax = 98%）[50]。清華大學饒燏課題組開發(fā)的 PROTAC 分子 P13I（33）可以同時降解野生型BTK（DC50 = 9.2 nmol · L-1，Dmax = 89%）和對 ibrutinib 耐藥的 C481S 突變的 BTK（DC50 = 30 nmol · L-1）[51]。該課題組開發(fā)的第 2 代 PROTAC 小分子L18I（34） 水溶性顯著提升且可降解不同 C481 突變的 BTK（DC50 < 50 nmol·L-1）[52]。PROTAC 分子 GMB-475（35）不僅可以降解野生型 BCR-ABL 還能降解特定突變的 BCR-ABL[15]。GMB-475 是基于 imatinib 的新穎 PROTAC 分子，在 300 nmol · L-1 下對 K562 和 Ba/F3 細胞的 BCR-ABL1 和 c-ABL1 均有顯著降解作用。GMB-475 對BaF3（T315I 突變）的 IC50 達1.98 μmol · L-1，活性是 imatinib 的 20 倍，對 G250E 突變的細胞株 IC50 達 0.37 μmol · L-1。在降解方面， GMB-475 可以完全降解 G250 突變蛋白（DC50 = 310 nmol · L-1）， 部分敲低 BCR-ABL1 T315I 蛋白。PROTAC 技術不僅在克服腫瘤耐藥性方面獲得重大進展，也有望被用于解決其他臨床疾病的耐藥性問題。Priscilla L.Yang 課題組設計并合成了首個可有效降解病毒蛋白的 PROTAC 分子——DGY-08-097（36）（DC50= 50 nmol · L-1）[53]。該研究工作成功證明可通過降解病毒蛋白的新策略解決病毒抑制劑的耐藥問題。
3.1.2 提高靶向選擇性
在結(jié)構(gòu)優(yōu)化中，增加化合物對靶蛋白的選擇性是藥物研發(fā)的重要目標。藥物在體內(nèi)的作用環(huán)境是復雜的，有許多潛在的因素會與之發(fā)生作用。蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂類、糖類、代謝物和其他小分子化合物都有可能與藥物相互作用 [54]。在許多情況下，這種相互作用會導致意想不到的生化反應，甚至是毒副作用。
CDK 是真核生物中保守的絲氨酸 / 蘇氨酸激酶家族，對細胞周期調(diào)節(jié)至關重要 [55]。CDK 家族共有 20 個亞型：CDK1、2、4 和 6 負責調(diào)控細胞周期，CDK7 ~ 13 負責調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；CDK14 ~ 20 作用機制尚不清楚，但廣泛地調(diào)控各種細胞活動 [56]。CDK9 是轉(zhuǎn)錄延長的重要調(diào)節(jié)因子，是腫瘤治療的一個有希望的靶點，特別是對于由轉(zhuǎn)錄失調(diào)引起的腫瘤 [57]。Nathanael S. Gray 課題組通過研究 SNS-032/CDK2 共晶結(jié)構(gòu)（PDB : 5D1J）[58]，設計合成了名為THAL-SNS-032 的小分子 PROTAC 化合物 [33]。THAL-SNS-032（37）保持了對 CDK1/CycB（IC50 =171 nmol ·L-1）、CDK2/CycC（IC50 = 62 nmol ·L-1）、CDK7/CycH/MNAT1（IC50 = 398 nmol · L-1）和 CDK9 CycT1（4 nmol · L-1）的泛抑制活性。更有趣的是， THAL-SNS-032 在 5 μmol · L-1 時可以僅降解 CDK9 而對其他 CDK 靶點幾乎沒有降解效果，說明通過靶蛋白與 E3 泛素連接酶之間的協(xié)同作用，PROTAC 分子可以在小分子抑制劑的基礎上提高其選擇性。最近，饒燏課題組通過系統(tǒng)地考察 PROTAC 連接鏈、連接鏈的成分、POI 配體以及親和力，發(fā)現(xiàn)了代表性化合物 CP-10 [59]。CP-10（38）是基于首個CDK4/6 的雙功能抑制劑 palbocilid 的 PROTAC，其僅對CDK6 表現(xiàn)出明顯的降解作用（DC50 = 2.1 nmol · L-1）。該研究表明，通過引入 PROTAC 技術可以將泛抑制劑轉(zhuǎn)變成選擇性降解劑，從而提高選擇性和靶向性。
3.1.3 可通過降解整個蛋白影響非激酶依賴型功能
在過去的幾十年發(fā)展中，酶抑制策略已被證明是許多傳統(tǒng)小分子藥物開發(fā)的有效手段。但是對某些非激酶依賴活性的疾病難以發(fā)揮有效的藥理活性。
黏著斑激酶（FAK）是腫瘤入侵、轉(zhuǎn)移的關鍵因子，同時也是多種信號蛋白的激酶和支架 [60]。盡管小分子 FAK 抑制劑在臨床前和臨床研究中取得一定進展 [61]，但 FAK 支架作用介導的許多基本功能仍然是激酶抑制劑所無法抑制的 [61-62]。為克服激酶抑制劑難以靶向 FAK 的缺點，Craig M. Crews 課題組研制了高選擇性、高活性的 FAK 降解化合物PROTAC-3（39，DC50 = 3.0 nmol·L-1，Dmax = 99%）[63]。PROTAC-3 在 FAK 激活以及 FAK 介導的細胞遷移和入侵方面均優(yōu)于臨床候選化合物 defactinib。其他作用于 FAK 的代表性小分子 PROTAC 還有 FC-11（40）[64] 和 BI-3663（41，DC50 = 27 nmol·L-1，Dmax = 95%）[65]。THAL-SNS-032（37）保持了對 CDK1/CycB（IC50=171nmol·L-1）、CDK2/CycC（IC50=62nmol·L-1）、CDK7/CycH/MNAT1（IC50 = 398 nmol · L-1）和 CDK9 CycT1（4 nmol · L-1）的泛抑制活性。更有趣的是， THAL-SNS-032 在 5 μmol · L-1 時可以僅降解 CDK9 而對其他 CDK 靶點幾乎沒有降解效果，說明通過靶蛋白與 E3 泛素連接酶之間的協(xié)同作用，PROTAC 分子可以在小分子抑制劑的基礎上提高其選擇性。最近，饒燏課題組通過系統(tǒng)地考察 PROTAC 連接鏈、連接鏈的成分、POI 配體以及親和力，發(fā)現(xiàn)了代表性化合物 CP-10 [59]。CP-10（38）是基于首個CDK4/6 的雙功能抑制劑 palbocilid 的 PROTAC，其僅對CDK6 表現(xiàn)出明顯的降解作用（DC50 = 2.1 nmol · L-1）。該研究表明，通過引入 PROTAC 技術可以將泛抑制劑轉(zhuǎn)變成選擇性降解劑，從而提高選擇性和靶向性。PROTAC 提供了同時阻斷 FAK 激酶信號和支架能力的可能性。該研究證明了 PROTAC 具有拓展藥物靶點空間和控制蛋白質(zhì)功能特別是非激酶依賴型功能（kinase-independent function）方面的潛力，而這些作用對于傳統(tǒng)的小分子抑制劑是不容易解決的。
3.1.4 有望降解“不可成藥”的靶點
傳統(tǒng)的小分子通過直接作用于靶蛋白表面具有一定深度的蛋白結(jié)合口袋（binding pocket）來調(diào)節(jié)蛋白功能。據(jù)統(tǒng)計， 人類超過 80% 的蛋白屬于“不可成藥”靶點 [66]。通常“不可成藥”靶點蛋白表面平坦光滑，傳統(tǒng)小分子難以尋找到有效的結(jié)合位點（binding site）。
信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子 3（STAT3）是細胞表面受體向細胞核傳遞信號的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。STAT3 信號激活在細胞生長、分化、凋亡、代謝及抑制腫瘤免疫反應等過程中扮演極其重要的作用 [67]。STAT3 是人類腫瘤和其他疾病極具吸引力的治療靶點。STAT3 結(jié)構(gòu)特殊，缺乏傳統(tǒng)小分子抑制劑可以直接作用的結(jié)合口袋，因而直接影響小分子抑制劑的研發(fā)。盡管在過去的幾十年中有相關的直接抑制劑被報道，但效果不佳且缺乏特異性，目前臨床上尚無有效藥物 [68]。王少萌課題組通過基于結(jié)構(gòu)的優(yōu)化策略從先前報道的 STAT3 高親和力擬肽化合物 CJ-887 出發(fā)，優(yōu)化得到 SI-109。分析 SI-109 與STAT3 的共晶結(jié)構(gòu)（PDB : 6NUQ）[69]，設計合成了STAT3 降解劑 SD-36（42）（DC50 = 60 nmol ·L-1）[70]。該研究工作首次證明 PROTAC 技術可以將“不可成藥”靶點轉(zhuǎn)化為“可成藥”（druggable）靶點，為后續(xù) PROTAC 技術在“不可成藥”靶點方面的應用奠定基礎。
RAS 是癌癥中最為常見的突變癌基因，也是腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動因素，約占所有癌癥的 30%[71]。由于 RAS 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，其靶向治療已成為抗腫瘤研究的一個熱點。近年來，隨著針對 K-RAS（G12C）突變蛋白的小分子藥物深入開發(fā)，直接抑制 RAS 的抑制劑取得了一定成功。然而，這些抑制劑對 G12C 突變腫瘤的適用性仍非常有限。因此，RAS 基因過去一度被認為是“不可成藥”靶點 [72]。目前已有學者報道了多種 E3 泛素連接酶如 Rabex-5[73]、亮氨酸拉鏈樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子因子1（LZTR1）[74] 和 β-TrCP [75] 等參與 RAS 的泛素化降解。近日，Eric S. 和 Nathanael S. Gray 課題組利用 K-RAS 抑制劑通過連接鏈的優(yōu)化得到基于 CRBN 的 PROTAC 分 子 XY-4-88（43）[76]。XY-4-88 可以誘導 GFP-KRASG12C 降 解。但 是，對內(nèi)源性KRASG12C 不能起到降解作用。未來還需要進一步探討 PROTAC 在降解內(nèi)源性 KRAS 方面的研究，為進一步尋找更廣泛有效的靶向 RAS 藥物帶來契機。
3.1.5 提供了一種新型的快速可逆的化學蛋白敲除方法
蛋白敲低策略是研究靶基因功能喪失后果的有效手段 [77]。從傳統(tǒng)意義上來說，基因功能喪失的研究主要是通過RNA 干擾 [78]、基于重組基因的敲除、CRISPR-Cas9 [79] 等基因編輯技術來開展的。然而，這些策略難以實現(xiàn)快速可逆的蛋白敲低 [80]。傳統(tǒng)的基因敲除與蛋白敲低技術實驗周期長、費用高等缺點給研究者帶來諸多挑戰(zhàn)，尤其在大型非靈長類動物上。此外，許多基因的缺失將導致胚胎死亡，限制了相關科學研究 [81]。作為一種新型、快速、高效的蛋白敲低模型的方法，PROTAC 是現(xiàn)有遺傳性工具的有效補充手段 [29, 82]。
3.2 PROTAC 面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展策略
3.2.1 打破“類藥五規(guī)則”的規(guī)律
由于 PROTAC 分子是由三部分組成，不可避免地導致相對分子質(zhì)量過大，且目前報道的 PROTAC 的相對分子質(zhì)量基本在800 以上，均不符合 Lipinski“類藥五規(guī)則”定律， 而該定律是小分子藥物細胞通透性和生物利用度的一個重要指標 [83]。如何提高細胞攝取率、生物利用度以維持 PROTAC 在生物體內(nèi)必要的暴露量，以及獲得具有理想的物理化學性質(zhì)的分子將是一大挑戰(zhàn)。面對這一挑戰(zhàn)，饒燏課題組系統(tǒng)地研究了 PROTAC 在小鼠、豬和恒河猴體內(nèi)的效果 [29]。結(jié)果表明，體內(nèi)實驗中 PROTAC RC32 可以顯著降低 FKBP12（DC50= 0.27 nmol · L-1）和 BTK 的濃度。雖然 PROTAC 相對分子質(zhì)量大，細胞通透性差，但還是可以通過連接鏈的優(yōu)化，以及靶蛋白配體的選擇來克服的。目前對于PROTAC 透過細胞膜的機制還不清楚，后續(xù)還需要更多的理論和實踐來支撐 PROTAC 的吸收、分布、代謝、排泄以及毒性研究。
3.2.2 繼續(xù)攻克“不可成藥”靶點
人體中多數(shù)藥靶為“不可成藥”靶點。如何攻克“不可成藥”靶點， 為疾病的治療提供多種選擇是未來藥物研發(fā)必須面臨的考驗。
目前報道的基于 PROTAC 技術的靶蛋白小分子降解劑靶向的多數(shù)靶點為可成藥靶點，而“不可成藥” 靶點甚少。未來還需要深入研究，獲取足夠的證據(jù)來佐證靶向“不可成藥”靶點的事實。
3.2.3 建立科學的評價體系
由于 PROTAC 在體內(nèi)能以亞化學劑量發(fā)揮催化循環(huán)作用，因此傳統(tǒng)的藥代動力學（PK）、藥效動力學（PD）方法不能很好地評估 PROTAC 的 PK 和 PD 性質(zhì)，針對 PROTAC 分子，目前尚無成熟的 PK 和 PD 評價體系，量效關系、時效關系的規(guī)律尚未完全掌握，蛋白降解所致的毒性尚未透徹了解。未來亟需建立合適的 PK 和 PD 評價體系。
3.2.4 完善 PROTAC 的理性藥物設計
PROTAC 分子設計也是 PROTAC 技術面臨的一大挑戰(zhàn)。目前僅有少數(shù)科學家成功解析出 PROTAC 的三元復合物 [45, 84]。Ciulli 課題組解析了 PROTAC 分子 MZ1 與靶蛋白 BRD4、E3 泛素連接酶 VHL 的三元復合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB : 5T35）[45]，發(fā)現(xiàn) MZ1 在拉近靶蛋白和 E3 泛素連接酶的同時，還可誘導靶蛋白和 E3 泛素連接酶結(jié)合界面之間的相互作用，連接鏈的組成和長度都對這種協(xié)同作用有較大影響。這對后續(xù)PROTAC 的理性設計具有實際指導意義。未來還需要更細致地從結(jié)構(gòu)上進一步闡明 PROTAC 的作用機制以及開展更多的構(gòu)效關系研究，為 PROTAC 的分子設計提供更多的指導。
3.2.5 拓展 E3 泛素連接酶配體
在蛋白酶體介導的蛋白降解過程中，E3 泛素連接酶是至關重要的組成部分。人體中已知的 E3 泛素連接酶有 600 多個，但迄今僅不到 1% 的 E3 泛素連接酶具有小分子配體 [85]， 目前報道的 90% 以上的 PROTAC 小分子化合物均以最為常見的 E3 泛素連接酶為招募對象，例如CRBN、VHL、MDM2、cIAP1[86]。如何拓展可用于PROTAC 技術的 E3 泛素連接酶也是 PROTAC 所面臨的挑戰(zhàn)之一。未來能否尋找到在特定細胞或組織中具有特異性的 E3 泛素連接酶及其配體也是必須考慮的一大科學問題。常見 E3 泛素連接酶配體有沙利度胺（44）、來那度胺（45）、泊馬度胺（46）、VHL 配體（47）、(-)-nutlin 3（48）、idasanutlin（49）、methyl bestatin（50）、MV1 配體（51）、cIAP 配體（52）、氨基酸選擇性雌激素受體降解劑（SERD，53）、橋接三環(huán) SERD（54）和單環(huán) SERD（55）等。
3.2.6 其他
PROTAC 只有在形成穩(wěn)定 的“靶蛋白-PROTAC-E3 泛素連接酶”三元復合物時才能高效特異性泛素化靶蛋白。然而，由于三元復合物的復雜體系難以捕獲，目前研究 PROTAC 介導的三元配合物的方法還不多見，主要有時間分辨熒光能量轉(zhuǎn)移法（TR-FRET）、AlphaLISA 法、表面等離子體共振法（SPR）和等溫滴定量熱法（ITC）[87-88]。雖然這些方法對三元復合物的形成的分析都有一定價值，但并不能完整概括出 POI 降解所需要的泛素- 蛋白酶體系統(tǒng)。目前大多數(shù)研究工作主要探討目標蛋白與泛素連接酶各自配體的“二元復合物”穩(wěn)定性。未來將深入考察“靶蛋白-PROTAC-E3 泛素連接酶” 三元復合物體系的穩(wěn)定性。
PROTAC 中間 Linker 的設計也至關重要，線性脂肪鏈烴或醚結(jié)構(gòu)有被氧化代謝的風險，大大減少了藥物暴露濃度與時間，加快 PROTAC 分子排出生物體外。如何構(gòu)建 PROTAC 中間連接鏈的長度與組成現(xiàn)在還沒有規(guī)律的認識。
最后，PROTAC 分子的復雜性給化學家也帶來了巨大的挑戰(zhàn)。Soural 研究團隊運用固相合成技術快速高效地合成了基于沙利度胺的 PROTAC 分子 [89]。未來亟待繼續(xù)開拓高效、快捷、無污染的合成技術平臺，從而為臨床研究以及后續(xù)的規(guī)模化生產(chǎn)提供充足的原料。
總的來說，任何干預內(nèi)源性蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)機制的藥物都需要高度的設計水平和特異性來調(diào)控一系列的生物學事件，這是一個重大的挑戰(zhàn)。相信通過學術界和制藥工業(yè)界廣大科研人員的共同努力，這些問題在不遠的將來都可以得到滿意的解決方案。
04、結(jié)語與展望
起初，Craig M. Crews 把 PROTAC 描述為“cute chemical curiosity”，可能僅僅是出于一種學術上的好奇心。如今，PROTAC 技術已成為新藥研發(fā)的新策略，為疾病的治療提供新方法，未來幾年將是PROTAC 發(fā)展的關鍵時期， 越來越多的 PROTAC小分子將進入臨床前和臨床研究，進一步檢驗PROTAC 的治療效果。PROTAC 面臨的各種問題將被逐一解決，成為繼小分子抑制劑、單克隆抗體之后的又一種重磅抗腫瘤手段。
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來源：藥學進展
