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嘉峪檢測網 2021-10-09 14:17
在蛋白質研究中您需要確定樣品中目標蛋白是否存在和蛋白大小。無論是檢測或調查疾病，或者是確定基因操作實驗的成功或失敗，還是確定食品樣品中潛在過敏蛋白的存在。為了確定您的目標蛋白質，您通常需要將它與許多其他蛋白區分開來，其中一些可能具有相似的特性或大小。蛋白質印跡（Western blot）就是一種可以提供這些分析能力的技術。
在本文中，我們將討論WB是什么、WB實驗是如何進行的、WB向我們展示了什么以及與相關分析技術有何不同。
什么是蛋白質印跡？
蛋白質印跡，有時也稱為蛋白質免疫印跡，是一種基于抗體的技術，用于檢測樣品中特定蛋白質是否存在、大小和濃度。該技術由Harry Towbin及其同事于1979年開發，由于該技術與Southern印跡（DNA印跡）相似，因此后來將其命名為“蛋白質印跡”。
簡而言之，溶液中的蛋白質通過電泳分離。轉移到合適的膜后，使用目標特異性抗體探測樣品。可以檢測這些抗體，并與已知標準或對照相比，評估結合蛋白的大小和濃度。
蛋白質印跡實驗方案（步驟）
下圖1顯示了蛋白質印跡的實驗方法。
圖1：蛋白質印跡實驗步驟概述。
蛋白質印跡凝膠
在進行蛋白質印跡之前，必須分離樣品中的蛋白質。這通常是通過蛋白質電泳實現的，例如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或天然PAGE，根據蛋白質的分子量或電荷分離蛋白質。選擇的具體分離方法取決于分析的目的。為了獲得清楚的圖像，樣品被離心以去除固體，以便在電泳中僅使用可溶部分的蛋白。如果您的目標蛋白在不溶部分（例如，細胞膜結合蛋白質）中，可以先研究預處理方法以首先將其釋放和溶解。固體蛋白會影響凝膠的運行，目標蛋白很可能會留在濃縮膠中。
上樣適當的標準樣本和大小標記也很重要，以解釋最終印跡的結果。
蛋白質印跡的上樣控制
了解上樣多少樣品非常重要，尤其是在嘗試比較不同樣品之間的蛋白質表達時，因為僅通過印跡可能無法看出這一點。例如，在評估蛋白印跡時，一個樣品的條帶可能比另一個樣品的亮度高兩倍。這可能意味著該樣品中目標蛋白的數量是其他樣品的兩倍，或者可能意味著一個泳道上樣的樣品數量或濃度更高。運行重復的蛋白質凝膠并用考馬斯染色顯影有助于消除這種不確定性，因為它會顯示總蛋白量在每個樣品通道中，可以揭示上樣的不一致。檢測所有樣品中普遍存在的蛋白質的表達，例如全細胞和細胞質樣品中的肌動蛋白，也可以用作上樣對照，有助于確保蛋白質樣品向膜的轉移一致。但是，在比較“對照”蛋白質表達不同的模型（例如變性模型）時，這種類型的對照可能會出現問題。
蛋白質轉移（印跡）
蛋白質必須從蛋白質凝膠轉移到適當的膜（通常是硝酸纖維素或聚偏二氟乙烯(PVDF)）以促進抗體探測。許多技術可用于轉移，包括毛細管轉移、擴散轉移和真空印跡，但由于其速度和效率，迄今為止最常見的是電印跡（也稱為電洗脫或電泳轉移）。在這里，蛋白質凝膠夾在轉移膜上并施加電流。來自凝膠的蛋白質被攜帶穿過并緊緊附著在膜上。
在電印跡中，還有多種轉移策略，稱為濕轉移、半干轉移和干轉移。濕轉移效率高，提供靈活的緩沖，但很耗時。半干轉移速度更快，具有靈活性，但對于大蛋白質而言，效率低于濕轉移。干式轉印既高效又快速，但與其他方法相比靈活性較差。
可以在使用可移除的染色劑（例如PonceauS.）進行探測之前評估轉移效率。
蛋白質印跡阻斷
由于印跡膜對蛋白質具有高親和力，因此在轉移后阻斷任何剩余的結合位點以防止隨后的測定檢測抗體的非特異性結合非常重要。這一步驟是通過將膜與蛋白質液體（如牛奶或血清）一起孵育來實現的。
蛋白質印跡洗滌
封閉后，重要的是在每個步驟之間清洗膜以去除多余的或未結合的試劑。洗滌不充分或不均勻會導致實驗質量差、斑塊印跡和高背景。然而，過度洗滌會減少目標信號，因此優化洗滌步驟的數量和持續時間很重要。確保膜被適當的緩沖液充分覆蓋并輕輕攪拌以均勻洗滌膜而不會損壞它。常用的緩沖液包括Tris緩沖液(TBS)和磷酸鹽緩沖液(PBS)，通常包含吐溫20（TBST和PBST）。
蛋白質印跡抗體
雖然可以對蛋白質印跡使用直接檢測（識別目標并且可檢測的單一抗體），但更多情況下使用間接方法（如下圖2）。在這里，一抗用于探測膜并結合存在的任何目標蛋白。然后，使用與一抗結合且可檢測的二抗。與所有步驟一樣，這一步驟也需要優化，在這種情況下選擇“正確”的抗體并確定最佳濃度，是良好印跡的關鍵。
圖2：直接與間接蛋白質印跡，所用示例顯示化學發光檢測。
蛋白質印跡二抗
當使用間接檢測法時，需要將多余的未結合的一抗從膜上洗掉后使用二抗。二抗應該對一抗的種類具有特異性（例如，如果一抗來自兔，則為小鼠抗兔），并具有所選檢測方法所需的偶聯物。
蛋白質印跡分析
有多種檢測和后續蛋白質印跡可視化的方法，包括比色、化學發光、熒光和放射性檢測，總結在下圖3中。
圖3：使用間接方法進行比色、化學發光、放射性和熒光檢測的示例。
比色和化學發光檢測需要酶檢測的抗體綴合，并且被認為是非常敏感的技術。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)是最常用的酶，HRP由于其穩定性、對大多數結合的適應性和低成本而受到普遍青睞。在檢測過程中，將底物添加到膜上，結合酶作用于該底物，引起化學變化。如果進行比色檢測，則選擇顯色底物，該底物將產生可直接可視化和成像的變化。然而，及時對印跡成像很重要，因為印跡干燥后顏色會褪色。在化學發光檢測中，產生的信號僅在酶和底物之間發生反應時持續（通常為1-24小時）。在此期間，可以通過曝光X射線膠片或使用數字成像進行永久記錄來記錄信號。
在熒光檢測中，檢測抗體與熒光團而不是酶結合。當特定波長的光照射在它們上時，它們會被激發并發出不同特定波長的光。然后可以使用數字成像器（例如光電二極管(APD)、光電倍增管(PMT)或電荷耦合器件(CCD)相機）直觀地捕捉到這一點。雖然需要專業設備來進行激發和檢測步驟，但熒光檢測中沒有底物步驟，從而縮短了實驗步驟。也可以在蛋白質印跡分析中使用多重熒光團。
過去廣泛使用放射性檢測，其中放射性同位素與檢測抗體結合，并在X射線膠片上檢測發射的輻射。然而，該技術需要特殊處理以保護人員免受輻射，而且價格昂貴并且由于放射性衰變而具有有限的保質期。因此，該技術大多已被其他可用的檢測方法所取代。
蛋白質印跡剝離
剝離是從蛋白質印跡膜上去除一抗和二抗的過程。如果您希望在特定印跡上研究多個目標蛋白而不是運行多個印跡，例如在樣品非常有價值或稀缺的情況下，這會很有幫助。
請注意，剝離也可能會從膜上去除一些蛋白質，因此無法在剝離前后進行定量比較，并且不應在剝離的膜上進行蛋白質缺失的檢查。
如果您打算剝離印跡，建議使用PVDF膜，因為它們在剝離后比硝化纖維素更能保留蛋白質。比色檢測還會留下永久性污漬，因此化學發光檢測適用于該應用。
如果可能，從低pH值的溫和剝離緩沖液開始，以最大限度地減少樣品損失，如果不成功，則嘗試通過清潔劑或加熱進行更嚴格的剝離步驟。
蛋白質印跡結果和定量
使用X射線膠片從蛋白質印跡實驗中獲得結果時，通常需要曝光多張膠片以優化曝光和顯影時間。時間不夠長，樣本帶可能很暗或根本不可見。時間太長，背景信號變得太強，條帶合并在一起，所得印跡非常暗且難以分析。與目標濃度不平衡的對照或大小標記也可能存在問題，其中一個在另一個足夠可見之前曝光過度。然后可以將膠片數字化以使用分析軟件進行進一步分析。
使用X射線膠片的檢測方法被認為是定性或半定量的。將樣品泳道中的條帶與對照和大小標記進行比較有助于確定樣品中目標的存在與否。然而，如果需要定量，例如使用基于CCD相機的設備進行數字成像，由于其更大的動態范圍、更高的靈敏度和更高的分辨率，提供了更好的選擇。無需重復耗時的X射線膠片曝光和顯影，即可微調曝光時間，從而優化信噪比。然后可以輕松地將其輸入到可以分析并比較數據的軟件中。
蛋白質印跡故障排除
蛋白質印跡實驗方案中存在許多出錯的機會，在此我們重點介紹一些常見問題并提供潛在的解決方案。
凝膠上蛋白質條帶的分離不充分/定位不佳——優化蛋白質凝膠百分比和運行時間以適合您的目標蛋白。
印跡上沒有任何東西，甚至兩marker都沒有——確保印跡套件按正確的順序放在一起，并且電流以正確的方向運行，否則您的樣品會印跡到緩沖液中。
印跡看起來凌亂、斑駁——確保在設置轉移時凝膠和膜之間沒有氣泡。確保膜完全浸沒并在孵育和洗滌步驟中輕輕混合，以產生均勻的結果。或者使用新鮮的封閉試劑。
高背景——封閉或洗滌可能不夠。
對照樣品的結果與預期結果不一致——優化抗體選擇/濃度以最大限度地減少非特異性/脫靶結合。檢查您的實驗假設和概念。
在最終印跡上很難看到條帶（太暗或太亮）——優化檢測階段的顯影時間以增加或減少信號強度。如果條帶太亮，也可能表明洗滌過度。優化抗體濃度并考慮您選擇的抗體也可能有所幫助。
Southern印跡與蛋白質印跡
蛋白質印跡旨在檢測特定蛋白質，而Southern印跡于1975年開發并以其發明者Edwin Southern的名字命名，用于檢測特定DNA序列。與蛋白質印跡一樣，樣品通過電泳分離并轉移到膜上。然而，在檢測之前，使用與您希望檢測的區域互補的序列的DNA片段來探測膜。
Northern印跡與蛋白質印跡
Northern印跡，由James Alwine、David Kemp和George Stark于1977年開發，用于檢測特定的mRNA序列。與蛋白質印跡和Southern印跡一樣，進行Northern印跡的樣品通過電泳分離并轉移到膜上。然后將具有與感興趣區域互補的序列的cDNA片段用作檢測前的探針。
蛋白質印跡與SDS-PAGE
SDS-PAGE是一種用于根據蛋白質分子質量分離蛋白質的電泳技術，而蛋白質印跡是檢測特定蛋白質存在所需的整個過程。SDS-PAGE通常是蛋白質印跡實驗方案中選擇的電泳技術，作為在印跡前分離樣品中所有蛋白質的一種手段。
蛋白質印跡目的
檢測樣品中目標蛋白的存在、大小和濃度的原因有很多，這些原因可以跨越多個科學學科。除了目標的存在與否，該技術還可以評估：
蛋白質-DNA相互作用——DNA結合蛋白與特定DNA序列的連接對于轉錄調控過程至關重要。Southwestern印跡（類似于蛋白質印跡，除了用DNA探測膜外）可用于識別基因調控研究中的轉錄因子。
蛋白質-蛋白質相互作用——這些對許多基本的細胞過程至關重要。蛋白質-蛋白質相互作用的檢測，使用已知的蛋白質印跡的變化遠印跡，可有助于闡明細胞功能和功能障礙。
翻譯后修飾(PTM)——PTM影響蛋白質折疊并因此影響功能，擴大蛋白質組多樣性。然而，異常的PTM與多種因素有關。因此，他們的研究引起了研究人員的極大興趣，蛋白質印跡提供了一種這樣的工具來做到這一點。
蛋白質異構體檢測——蛋白質可能在不同細胞狀態下以不同的異構體表達，具有不同的活性或目標。或者，它們可能需要裂解才能被激活。
抗體表征——當抗體作為工具或療法生產時，它們的驗證和表征對確保正確的性能和安全性至關重要。作為一種基于抗體的方法，蛋白質印跡是該過程中的一項有用技術。
表位作圖——了解抗體如何以及在何處結合其靶蛋白對于研究、診斷和治療目的很有價值。有許多工具可用于實現這一目標，并且由于其特殊性，蛋白質印跡就是其中之一。
亞細胞蛋白定位——對不同細胞組分進行蛋白質印跡分析可以確定目標蛋白在細胞中的位置。單細胞蛋白質印跡在該領域提供了很好的見解，并克服了其他單細胞檢測所遇到的一些抗體交叉反應問題。
下面討論一些常見的應用。
確定蛋白質是否表達
評估基因組數據可以告訴您所討論的生物體是否有可能產生某些蛋白質。查看轉錄組會告訴您相關基因是否已開啟，但直到您能夠檢測到實際蛋白質，您才能判斷它是否正在積極表達。在進行實驗性基因組操作時，這非常有助于確定基因組水平的變化是否反映在蛋白質水平的預期變化（例如，與野生蛋白質相比，新蛋白質的表達、截斷或表達缺失）。菌株或者細胞是否在預期的組織或位置中表達？
檢測標記蛋白
在進行基因操作時，可以設計和添加標簽，例如His標簽和GST標簽。這使得它們所附著的蛋白質很容易在所研究的物種或系統的樣本中找到，從而提供有關相關蛋白質的位置和特征的信息。例如，是在某些條件下從細胞膜上裂解下來的膜蛋白。這在檢查實驗產生的重組蛋白時也很有用。
映射隨時間或組之間的變化
對時間過程實驗樣品進行蛋白質印跡可以提供有關蛋白質水平隨時間變化的信息，例如在不同的細胞周期階段。同樣，當比較來自不同疾病或治療組的樣本時，它可以突出蛋白質水平的變化，這可能表明疾病的根本原因或影響治療效果。
總的來說，與PCR之類的技術相比，蛋白質印跡不被認為是一種特別的定量技術。然而，它提供的蛋白質的直接檢測意味著它在確診疾病診斷中具有很大的實用性。
非傳染性疾病的生物標志物
不同的蛋白質亞型可以作為病理過程的生物標志物，例如在癌癥中。自身抗體，表明自身免疫性疾病，也可能被檢測到。雖然質譜法常用于檢測，但仍使用蛋白質印跡等基于抗體的技術來確認高通量方法的發現。
傳染病診斷
Western印跡被用于疾病確認情況下，如人免疫缺陷病毒（HIV），萊姆病，牛海綿狀腦病（BSE）和曲霉病。然而，與PCR等技術相比，它非常耗時，并且在包括HIV檢測在內的許多情況下已被替代分析所取代。
文章來源：
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來源：藥時空
