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酶聯(lián)免疫結(jié)合法中，馬鈴薯的預(yù)處理很簡(jiǎn)單，只需將馬鈴薯組織搗碎均勻并稀釋即可。同時(shí)，該方法具有敏感性、特異性的特點(diǎn)，并且有一個(gè)很好的終點(diǎn)判斷;且該方法不需要昂貴的儀器。但缺點(diǎn)是獲得抗原和抗體所經(jīng)歷的時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)的操作時(shí)間也比較長(zhǎng)。

 

四、馬鈴薯中龍葵堿提取及測(cè)定：

龍葵堿不溶于水、乙醚和石油醚，可溶于甲醇、乙醇、戊醇、丙酮等。對(duì)堿較穩(wěn)定，pH 大于8 時(shí)沉淀。經(jīng)稀酸水解后，可生成茄健和相應(yīng)的糖(包括葡萄糖、鼠李糖和半乳糖)。在稀硫酸性環(huán)境下，與酸反應(yīng)生成茄嚨。茄嚨在酸性環(huán)境中與甲醛溶液作用生成橙紅色化合物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與茄嚨含量成正比。可用分光光度計(jì)在520nm 處測(cè)定。

根據(jù)所用的有機(jī)溶劑種類和數(shù)量的不同，現(xiàn)有的主要方法可分為單溶劑法，雙溶劑法和混合溶劑法等。混合溶劑法所需試劑較貴，同時(shí)試驗(yàn)過(guò)程中需要昂貴的儀器，使成本過(guò)高。雙溶劑法的乙醇一乙酸法和單溶劑法的甲醇法都有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，乙醇一乙酸法需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，而甲醇法使用的甲醇有毒，且準(zhǔn)確度偏低。本試驗(yàn)利用單溶劑乙醇替代甲醇，結(jié)合乙醇一乙酸法的試驗(yàn)流程并改進(jìn)，比較研究了乙醇法與乙醇一乙酸法提取馬鈴薯中龍葵堿的效果。

 

1. 材料與方法

 

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯:取適量馬鈴薯，發(fā)芽處理。洗凈，組織搗碎機(jī)搗碎，混勻。60℃烘干，植物樣品粉碎機(jī)粉碎，備用龍葵堿標(biāo)準(zhǔn)品:a一茄堿，購(gòu)于sigma公司，純度)99.8%

 

1.2 儀器與試劑

95%乙醇: AR，GB679 一94

1%硫酸:量取5.65ml 濃硫酸，緩緩注入冷水中，于I000ml容量瓶中定容，搖勻

1%甲醛: 量取25ml 的甲醛，加入冷水中，于1000ml 容量瓶中定容，搖勻

濃氨水: AR，GB631 一89

1%氦水: 量取45.5ml的濃氨水，加入冷水中，于1000ml容量瓶中定容，搖勻

濃硫酸: AR

冰乙酸: AR，GB676 一90

儀器：磁力攪拌器、水浴鍋、索氏脂肪提取器、貝克曼分光光度計(jì)、圓底燒瓶、直形冷凝管、電子天平(2009，0.lmg)、組織搗碎機(jī)、植物樣品微粒粉碎機(jī)。

 

2.提取分離方法

乙醇法:稱取209 的馬鈴薯鮮樣品，將樣品和幾個(gè)玻璃珠(防止加熱沸騰)放置于250ml的圓底燒瓶中，添加100ml的95%乙醇，將圓形燒瓶連接直形冷凝管，放置于水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度為85 一95℃，水浴4 個(gè)小時(shí)。冷卻，過(guò)濾取濾液，回收乙醇近干，然后將剩余的乙醇倒入蒸發(fā)皿中，將乙醇蒸干。用30ml 的5%硫酸溶解剩余物，過(guò)濾，收取濾液，加入濃氨水調(diào)節(jié)PH 值為10 一10.5，冷卻，放置于冰箱過(guò)夜。

4℃，5000r/min 離心，去上清液，用l%氨水洗滌，再離心，洗滌，至洗滌液澄清，離心，取沉淀即得粗樣品。

乙醇一乙酸法:稱取2 鮑的烘干馬鈴薯鮮樣品，加100ml 乙醇和3ml 乙酸，磁力攪拌器攪拌15 分鐘，過(guò)濾。濾液裝入索氏脂肪抽提器的稱脂瓶，濾渣用濾紙包住，放入索氏脂肪提取器的濾紙筒內(nèi)，水浴抽提16 小時(shí)后，回收乙醇近干，然后將剩余的乙醇倒入蒸發(fā)皿中，將乙醇蒸干。用30ml 的5%硫酸溶解剩余物，過(guò)濾，收取濾液，加入濃氨水調(diào)節(jié)pH值為10~10.5，冷卻，放置于冰箱過(guò)夜。4℃，5000r/min離心，去上清液，用1%氨水洗滌，再離心，洗滌，至洗滌液澄清，離心，取沉淀即得粗樣品。

3.測(cè)定方法

龍葵堿標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取0.0500g 龍葵堿，加入l%硫酸溶液溶解，移入50ml容量瓶中，加入1%硫酸溶液至刻度，搖勻。此溶液每ml 含龍葵堿lmg。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml標(biāo)準(zhǔn)溶液以1%硫酸稀釋到2ml，置冰浴中逐漸加入5ml硫酸(宜于3分鐘以上時(shí)間滴完)，放置1分鐘，然后置冰浴中滴加2.5mll%甲醛(在2 分鐘以上時(shí)間滴完)，放置90 分鐘后，于520nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

樣品的測(cè)定:將提取的粗樣品用l%硫酸溶解，定容到10ml。取2ml 的樣品溶液，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備同樣操作，先預(yù)測(cè)其大概濃度，再以1%硫酸調(diào)節(jié)樣品濃度，使之每毫升在0.2mg 以下，取2ml按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作，于520nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

 

4.馬鈴薯中龍葵堿含量的計(jì)算公式

X（mg/100g）=（P*V*50）/m

式中X—100g樣品中所含龍葵堿的量

P—測(cè)定結(jié)果相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度（mg/ml）

V 一樣品提取之后定容總體積(ml)

m 一樣品量(g)

譜圖示例