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雙抗又稱為“雙靶點(diǎn)”或“雙特異性”抗體，可以結(jié)合同一細(xì)胞或不同細(xì)胞表面的不同靶點(diǎn)，也可以結(jié)合不同的可溶性靶點(diǎn)，甚至還可以是同一靶點(diǎn)的兩個(gè)不同表位。常見(jiàn)的雙抗作用示意圖如下，圖A代表同一細(xì)胞不同靶點(diǎn)，圖B代表不同游離靶點(diǎn)，圖C、D、F代表不同細(xì)胞的不同靶點(diǎn)，只不過(guò)Fc功能有所區(qū)別，圖E則代表結(jié)合可內(nèi)吞膜受體及內(nèi)吞后的膜內(nèi)靶點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)雙抗的多功能，其結(jié)構(gòu)也是多種多樣，如下表所示，有IgG樣，也有非IgG類型的。

結(jié)構(gòu)和功能的多樣，為雙抗的臨床藥理學(xué)研究也帶來(lái)一些挑戰(zhàn)。相較于傳統(tǒng)的單抗，雙抗的臨床藥理學(xué)方面也有些特殊考量。本文圍繞雙抗臨床藥理學(xué)研究展開(kāi)討論，并分享若干案例。

PK/PD

FDA在2021年頒布的《Bispecific Antibody Development Programs Guidance for Industry》中提到雙抗的活性形式可能是個(gè)混合物，既包括有活性的組分（如未結(jié)合配體、結(jié)合1個(gè)配體的形式）和失活的組分（如不能結(jié)合配體的形式），應(yīng)結(jié)合PD指標(biāo)，鑒定出與PD最相關(guān)的組分。因此，可能需要開(kāi)發(fā)不只一個(gè)方法以鑒定多種形式的分子。有時(shí)也可用PD方法代替，比如后續(xù)案例中的Blinatumomab就屬于這類情況。

另外，雙抗引起的免疫反應(yīng)，有可能只是針對(duì)其中1個(gè)結(jié)構(gòu)域，抑制了1個(gè)靶點(diǎn)的功能，另一個(gè)靶點(diǎn)的功能卻是完整的。因此，有可能需要開(kāi)發(fā)針對(duì)不同雙抗結(jié)構(gòu)域免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法。考慮到雙抗結(jié)構(gòu)的多樣性及復(fù)雜性，F(xiàn)DA鼓勵(lì)企業(yè)就特定產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)計(jì)劃與其臨床藥理部門進(jìn)行溝通。

免疫原性、生物標(biāo)記物

雙抗作為治療性蛋白，也會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)。通常通過(guò)檢測(cè)抗藥抗體（antidrug antibodies, ADA）評(píng)估藥物的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。但并不是所有抗體都會(huì)形成ADA，比如單抗rilotumumab的ADA發(fā)生率就是0%。雙抗產(chǎn)品catumaxomab的ADA發(fā)生率也是0%，blinatumomab的ADA發(fā)生率為1%。影響雙抗ADA形成的風(fēng)險(xiǎn)因素與其它單抗類似，包括雙抗結(jié)構(gòu)、是否存在外源序列、給藥途經(jīng)（SC較IV具有更高的ADA發(fā)生率）及患者免疫系統(tǒng)狀態(tài)。ADA的形成會(huì)影響PK，繼而影響PD。

雙抗的生物標(biāo)記物開(kāi)發(fā)通常會(huì)面臨諸多挑戰(zhàn)。雙抗需要兼顧兩個(gè)靶點(diǎn)的生物學(xué)作用，甚至需要找到針對(duì)兩個(gè)靶點(diǎn)的特定marker。比如BiTE抗體結(jié)構(gòu)的blinatumomab，既需要證明T細(xì)胞的參與，又需要評(píng)價(jià)腫瘤靶點(diǎn)CD19的情況。前者可以通過(guò)檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病患者中CD69和CD25表達(dá)的上調(diào)實(shí)現(xiàn)。

藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）

有研究統(tǒng)計(jì)過(guò)FDA批準(zhǔn)的68個(gè)治療性蛋白新藥，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)是單抗類藥物出現(xiàn)DDI的主要風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞因子會(huì)影響肝臟CYP酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。很多生物藥物通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，間接影響CYP酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體。而細(xì)胞因子對(duì)CYP酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響程度，取決于細(xì)胞因子水平、細(xì)胞因子類型及細(xì)胞因子升高的持續(xù)時(shí)間。雙抗藥物很多是依賴T細(xì)胞發(fā)揮作用，典型的是以CD3-TAA為代表的分子。這類藥物的免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)，多數(shù)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，潛在的DDI風(fēng)險(xiǎn)較其它產(chǎn)品也高。

臨床DDI研究可以通過(guò)群體藥代動(dòng)力學(xué)（Population PK, PPK）實(shí)現(xiàn)。可以將PPK嵌入Ⅱ、Ⅲ期大型臨床試驗(yàn)中，從多個(gè)研究中匯集數(shù)據(jù)。

監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于治療性蛋白的DDI研究也給出過(guò)建議。2007年，EMA出臺(tái)《Guideline on the Clinical Investigation of the Pharmacokinetics of Therapeutic Proteins》，指出免疫調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞因子具備潛在誘導(dǎo)或抑制CYP酶的潛力，可以改變共同給藥的小分子化藥的代謝行為。建議對(duì)這類蛋白產(chǎn)品開(kāi)展?jié)撛诘捏w內(nèi)或體外研究，以確認(rèn)該風(fēng)險(xiǎn)。

基于模型的臨床藥理學(xué)研究

通過(guò)對(duì)臨床前PK參數(shù)數(shù)學(xué)建模預(yù)測(cè)臨床PK在單抗中已經(jīng)比較常見(jiàn)，常用的是異速縮放模型。該模型在線性PK的抗體中表現(xiàn)最好。當(dāng)然，適用于非線性PK的模型也已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)了。單抗的模型使用經(jīng)驗(yàn)同樣適用于雙抗。比如EGFR-HER3雙抗MEHD7945A就是采用食蟹猴二室模型獲得PK參數(shù)，經(jīng)定量藥理模型（Species-invariant time method）轉(zhuǎn)化后預(yù)測(cè)人體PK。

雙抗的生物分析之前寫(xiě)過(guò)一篇單獨(dú)的文章進(jìn)行描述，有興趣可翻看。雙抗PK檢測(cè)的獨(dú)特性及已上市雙抗PK檢測(cè)方法匯總

分享幾個(gè)案例。

案例一：Catumaxomab

Catumaxomab是一款CD3-EpCAM雙抗，2009年被EMA批準(zhǔn)上市，通過(guò)腹膜內(nèi)給藥途徑，治療腫瘤相關(guān)的惡性腹水。嚴(yán)格意義上講，Catumaxomab應(yīng)該算是一個(gè)三抗。如下圖所示，Catumaxomab是由結(jié)合CD3的抗體、結(jié)合腫瘤抗原EpCAM的抗體以及結(jié)合Fc受體的恒定區(qū)組成，是具備Fc介導(dǎo)的ADCC、ADCP等效應(yīng)功能的多抗。相較于EpCAM單抗，Catumaxomab的活性強(qiáng)1000多倍。

Catumaxomab首次人體臨床試驗(yàn)采用的靜脈注射給藥，低劑量即出現(xiàn)了急性肝衰竭、細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)的嚴(yán)重系統(tǒng)毒性。之后開(kāi)發(fā)了腹腔注射給藥途徑，解決了因靜脈給藥大量非特異性T細(xì)胞激活導(dǎo)致的嚴(yán)重毒性反應(yīng)，并顯示了不錯(cuò)的藥效。

Catumaxomab的生物分析采用ELISA方法，雙抗夾心原理，包被的抗體大鼠IgGλ輕鏈特異性抗體，檢測(cè)抗體為生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG2a抗體。此方法檢測(cè)的總的藥物濃度，包括所有靶點(diǎn)結(jié)合、非結(jié)合的藥物形式。

PK/PD研究方面，惡性腹水患者接受4個(gè)劑量（10、20、50、150μg/kg）IP注射給藥。腹水中可檢測(cè)到高濃度的catumaxomab暴露。藥物濃度隨著給藥劑量升高而增加，峰濃度可在末次藥后19h觀測(cè)到。消除半衰期約2.13天。PD反應(yīng)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子釋放（TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10）得以確認(rèn)。臨床Ⅱ/Ⅲ期研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)升高13%可以作為潛在良好預(yù)后的PD biomarker。此外，PD方面還觀察到catumaxomab可以完成效應(yīng)T細(xì)胞從外周血到組織的再分布，擴(kuò)增EpCAM特異性T細(xì)胞，還能產(chǎn)生針對(duì)不同腫瘤抗原的殺傷活性。

由于catumaxomab的Fc采用的是大鼠和小鼠IgG，因此ADA風(fēng)險(xiǎn)潛在比較高。不過(guò)有意思的是，catumaxomab僅在末次藥后檢測(cè)到ADA，末次藥前時(shí)間點(diǎn)并未發(fā)現(xiàn)ADA存在。另外，抗小鼠抗體陽(yáng)性的患者的無(wú)穿刺生存期是要長(zhǎng)于抗體陰性患者的。出現(xiàn)這一反常藥效的原因，可能跟免疫原性更強(qiáng)的患者潛在具備更強(qiáng)的免疫反應(yīng)有關(guān)。

案例二：Blinatumomab

如下圖所示，Blinatumomab是BiTE雙特異抗體結(jié)構(gòu)，由CD3抗體和CD19抗體組成。作用機(jī)制也比較容易理解，就是利用患者自身的T細(xì)胞，通過(guò)CD3抗體再定位，殺傷自身CD19陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。Blinatumomab在pmol濃度即可激活T細(xì)胞，而且不依賴組織相容性復(fù)合體的抗原遞呈和T細(xì)胞受體。

Blinatumomab與小鼠、大鼠和犬的抗原均不結(jié)合。為開(kāi)展非臨床研究，構(gòu)建了抗鼠CD3和CD19的替代分子。雖然替代分子可以誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞激活，并裂解小鼠B細(xì)胞，能使細(xì)胞因子釋放增加，與blinatumomab的作用機(jī)制類似。但是，Amgen并未基于替代分子的數(shù)據(jù)，采用傳統(tǒng)方法計(jì)算FIH起始劑量，而是采用了“trial and error”的路徑。個(gè)人理解的是“試錯(cuò)”。實(shí)際情況是，Amgen先開(kāi)展了3個(gè)小規(guī)模的臨床Ⅰ期預(yù)試驗(yàn)。Blinatumomab每周給藥1次、2次、3次，每次輸注2或4h。結(jié)果由于未見(jiàn)明顯臨床獲益，且出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)的不良反應(yīng)（Adverse effect, AE），這三個(gè)試驗(yàn)均被終止。當(dāng)然，也不是一無(wú)所獲，研究中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子升高、輕度的T細(xì)胞激活和外周血B細(xì)胞的降低提示了blinatumomab的MOA是發(fā)揮作用的。此外，研究中出現(xiàn)的AE主要發(fā)生在給藥開(kāi)始階段。該項(xiàng)目如果想繼續(xù)推進(jìn)，面臨的難題是如何實(shí)現(xiàn)藥效和毒性的平衡？Amgen團(tuán)隊(duì)認(rèn)為blinatumomab的半衰期短，需要持續(xù)保持一定的有效暴露才能確保藥效的發(fā)揮。另外，為解決AE問(wèn)題，可以通過(guò)step dosing實(shí)現(xiàn)，同時(shí)給予糖皮質(zhì)激素類藥物預(yù)處理。

在后續(xù)擴(kuò)展的Ⅰ期臨床研究中，給藥方案調(diào)整為0.5-90μg/m2/天，連續(xù)輸注4或8周。具體方案分為兩種，一種是0.5、1.5、5、15、30、60、90μg/m2/天flat dosing；一種是5-15、5-30、5-60、15-60μg/m2/天 1-step dosing、5-15-60μg/m2/天 2-step dosing，即先用低劑量誘導(dǎo)，個(gè)體內(nèi)逐步提升劑量。結(jié)果顯示step dosing更優(yōu)，解決了前期面臨的藥效-毒性平衡的問(wèn)題。

Blinatumomab的生物分析方法比較特別，采用的流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測(cè)的T細(xì)胞表面的CD69表達(dá)。CD69是T細(xì)胞活化的biomarker之一，且具有濃度依賴性。Amgen認(rèn)為，基于細(xì)胞活性的方法相較于ELISA檢測(cè)血藥濃度是有優(yōu)勢(shì)的。個(gè)人比較好奇的是，細(xì)胞活性方法畢竟是間接反映blinatumomab暴露情況，能替代直接的血藥濃度檢測(cè)嗎？CD69更像是PD指標(biāo)，兩者同時(shí)進(jìn)行是否更好一些，既檢測(cè)直接檢測(cè)血藥濃度的方法，同時(shí)觀測(cè)CD69表達(dá)情況。

PK/PD方面，blinatumomab沒(méi)有Fc，不涉及FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)，進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)被快速代謝成小肽，從外周快速清除。Blinatumomab在人體內(nèi)呈線性PK，未見(jiàn)靶介導(dǎo)的消除。Blinatumomab主要在外周血中分布，表觀分布容積3-5L，與血容量相當(dāng)。Blinatumomab的消除半衰期約2h。PD方面，blinatumomab唯一激活的免疫細(xì)胞是T細(xì)胞。人體給予blinatumomab后，T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)增殖，之后分泌顆粒酶、穿孔素，殺掉腫瘤靶細(xì)胞。其它PD作用還包括，T細(xì)胞的再分布，劑量依賴性B細(xì)胞耗竭及一過(guò)性細(xì)胞因子升高。

體內(nèi)ADA的產(chǎn)生需要B細(xì)胞的參與。Blinatumomab對(duì)B細(xì)胞的耗竭作用降低了其ADA風(fēng)險(xiǎn)。Blinatumomab的ADA陽(yáng)性率僅為1%左右。個(gè)別患者能看到ADA對(duì)PK的影響，主要體現(xiàn)在血藥濃度的降低。但是，由于ADA發(fā)生率太低，無(wú)法就ADA是否對(duì)安全性或有效性造成影響得出確切結(jié)論。

體外人體肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示blinatumomab不影響CYP450酶的活性。不過(guò)細(xì)胞因子對(duì)CYP450酶的表達(dá)有潛在影響，而blinatumomab會(huì)引起細(xì)胞因子一過(guò)性升高。體外研究顯示，細(xì)胞因子雞尾酒（多種因子混合）呈濃度和時(shí)間依賴性的抑制CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9的活性。細(xì)胞因子抑制肝臟CYP450酶的主要因子是IL-6。采用PBPK模型預(yù)測(cè)IL-6對(duì)肝臟CYP450酶的抑制程度和持續(xù)時(shí)間。結(jié)果顯示，臨床峰濃度的IL-6可以抑制CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9的活性達(dá)30%，持續(xù)一周左右。雖然DDI風(fēng)險(xiǎn)不高，但確實(shí)有可能造成CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9為底物的藥物暴露量增加。

案例三：Solitomab（AMG110, MT110）

如下圖所示，Solitomab結(jié)構(gòu)與blinatumomab類似，也是BiTE結(jié)構(gòu)，由EpCAM和CD3單鏈抗體組合而成。

Solitomab的FIH劑量為1-96μg/天。1μg/天的起始劑量是采用替代分子在小鼠中的數(shù)據(jù)基于最低預(yù)期生物效應(yīng)水平（minimal anticipated biological effect level, MABEL）獲得。劑量爬升過(guò)程中出現(xiàn)的主要?jiǎng)┝肯拗菩远拘允歉喂δ墚惓：蛧?yán)重的腹瀉。為控制肝酶升高，采用的方案是從3μg/天開(kāi)始，分步進(jìn)行個(gè)體內(nèi)劑量爬升，有點(diǎn)類似blinatumomab用過(guò)的策略。此外，給藥前3天還需要給予糖皮質(zhì)激素處理。嚴(yán)重腹瀉限制了給藥周期，使相對(duì)高劑量下的最長(zhǎng)輸注時(shí)間不能超過(guò)3或4周。

Solitomab的PK行為呈線性，24h內(nèi)即達(dá)到穩(wěn)態(tài)，消除半衰期約4.5h。96μg/天對(duì)應(yīng)的Cmax約為6ng/mL。長(zhǎng)期重復(fù)給藥未引起T細(xì)胞失能或損害T細(xì)胞的效應(yīng)功能。7/63（11%）患者檢測(cè)ADA，其中2例患者發(fā)現(xiàn)PK行為的改變。ADA陽(yáng)性的患者未見(jiàn)過(guò)敏或其它超敏反應(yīng)癥狀。