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嘉峪檢測網 2022-12-02 15:21
剛剛，國家藥監局器審中心發布《流行性感冒病毒核酸檢測試劑注冊審查指導原則（征求意見稿）》，全文如下：
流行性感冒病毒核酸檢測試劑注冊審查指導原則
本指導原則旨在指導注冊申請人對流行性感冒病毒（以下簡稱流感病毒）核酸檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。
本指導原則是對流感病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。
本指導原則是供注冊申請人和技術審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。
本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，相關內容也將適時進行調整。
一、適用范圍
本指導原則適用于采用逆轉錄實時熒光PCR法，對人口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、鼻拭子、抽吸液等呼吸道分泌物樣本中的流感病毒核酸進行體外定性的檢測試劑。
對于采用其他方法學或其他樣本類型的流感病毒核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內容不夠全面，申請人可參照本指導原則，根據產品特性對適用部分進行評價，并補充其他的評價資料。
流感病毒屬于正粘病毒科，是單股、負鏈、分節段的RNA病毒。根據核蛋白和基質蛋白不同可分為甲、乙、丙、?。ɑ駻、B、C、D）四型。甲型流感病毒根據病毒表面的血凝素（hemagglutinin，HA）及神經氨酸酶（neuraminidase，NA）的蛋白結構和基因特異性，可分為多種亞型。目前發現的HA和NA分別有18個（H1-18）和11個（N1-11）亞型。乙型流感病毒分為Victoria系和Yamagta系。目前引起流感季節性流行的病毒是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagta系。
流感病毒核酸檢測試劑可用于流感的輔助診斷，甲型流感病毒各亞型的核酸檢測試劑還可用于區分季節性流感病毒和新型甲型流感病毒，并可獲得關于流感暴發的流行病學信息。
本指導原則適用于進行相關注冊申請和變更注冊申請的產品。本指導原則針對流感病毒核酸檢測試劑注冊申報資料中的部分內容進行撰寫，其他未盡事宜應當符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關法規要求。
二、注冊審查要點
?。ㄒ唬┍O管信息
1. 產品名稱及分類編碼
產品名稱應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關法規的要求，如甲型/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據《體外診斷試劑分類規則》，該產品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。
2. 其他信息還包括產品列表、關聯文件、申報前與監管機構的聯系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。
（二）綜述資料
綜述資料主要包括概述、產品描述、預期用途、申報產品上市歷史及其他需說明的內容。應詳細說明產品所采用的技術原理及檢測流程。提供不同適用機型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數。提供核酸提取（手工和自動提取方式應分別明確）和PCR擴增的時間，以及檢測全過程所需的時間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時間。與已上市同類產品進行比較，比較內容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內標，質控品，判讀規則，分析性能和臨床性能等。
預期用途中明確產品檢測的靶基因，需選擇保守性和特異性相對較高的基因，同時還應考慮基因的擴增效率。檢測基因的選擇應提供相關指南或文獻，并分析所檢測基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。
（三）非臨床資料
1. 產品技術要求及檢驗報告
注冊申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據產品研制、前期評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻資料，結合產品特性按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求編寫。該類產品作為第三類體外診斷試劑，應當以附錄形式明確主要原材料以及生產工藝要求。
甲型、乙型流感病毒核酸檢測試劑已有國家參考品，技術要求中應體現國家標準品的相關要求，并使用國家參考品對三批產品進行檢驗。
如果有適用的國家標準、行業標準，產品技術要求的相關要求應不低于相應的要求。
2. 分析性能研究
注冊申請人應采用在符合質量管理體系的環境下生產的試劑盒進行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數據、統計分析等詳細資料。
如申報產品適用不同的機型，需要提交采用不同機型進行性能評估的資料。如申報產品包含不同的包裝規格，需要對各包裝規格進行分析或驗證。
適用的不同樣本類型應分別進行分析性能研究。
分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數據等。研究中采用的流行性感冒病毒陽性樣本，應采用合理方法確定其陰陽性和濃度水平，包括拷貝數、Ct值、TCID50值等，并提交具體的實驗資料。建議采用國際標準品建立校準曲線的方法確定研究樣本的濃度。分析性能評估用樣本一般應為真實樣本或病毒培養物，如涉及稀釋后檢測，應采用與適用樣本類型一致的陰性基質。不可采用質粒、假病毒或體外轉錄RNA 進行分析性能評估。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應相互獨立。
2.1樣本穩定性
考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應對樣本穩定性進行研究，包括采集后未經處理的樣本，加入不同裂解液/消化液的樣本，滅活處理后的樣本，研究內容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數等。
如產品適用拭子、痰液等不同的樣本類型，因其中干擾物質存在較大差異，可能對病毒RNA降解的影響不同，建議對每種樣本類型均進行穩定性研究。
如核酸提取液可不立即進行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩定性進行研究。
2.2適用的樣本類型
列明產品適用的樣本類型。
2.3準確度
采用申報試劑與診斷準確度標準或已上市產品，同時檢測臨床樣本，比較檢測結果之間的一致性程度，進行申報試劑的準確度評價。
樣本應選擇符合樣本穩定性的預期人群樣本。研究應納入一定數量的陰性和陽性樣本，并注意包含一定數量的陽性判斷值附近的樣本和干擾樣本。
2.4企業參考品驗證
根據主要原材料研究資料中的企業參考品設置情況，采用三批產品對企業參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數據。
2.5精密度
應對精密度指標，如標準差或變異系數等的評價標準做出合理要求。應考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進行評價。
精密度評價試驗應包含核酸提取步驟。設定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數據進行統計分析，獲得重復性、實驗室內精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結果。
應采用臨床樣本進行精密度評價，應至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據產品特性設定適當的精密度要求，例如：
陰性樣本：不含待測物或待測物濃度為零時，陰性檢出率應為100%（n≥20）。
臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應≥95%（n≥20）。
中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤10%（n≥20）。
2.6檢出限
2.6.1檢出限的確定
建議使用不同來源的至少3例臨床樣本或病毒培養物采用梯度稀釋的方式進行檢出限的確定，每個梯度的病毒稀釋液重復3～5份，每份稀釋液重復檢測不少于20次，將具有95%陽性檢出率的病毒水平作為檢出限。申請人可采用半數組織感染量測定法（TCID50）的方法進行毒株濃度確認，以TCID50/mL作為毒株濃度的表示方式；也可采用空斑形成單位（PFU）的方式進行毒株濃度確認，以PFU/mL作為毒株濃度的表示方式。除此之外，申請人還應采用數字PCR、標準曲線等方法進行毒株核酸濃度的確認，以copies/mL作為毒株濃度的表示方式。
在進行檢出限建立時申請人應對申報產品聲稱可檢測流感病毒的類型及其亞型分別進行研究，甲型流感病毒應至少包括H1N1、H3N2亞型，乙型流感病毒應包括Victoria系和Yamagta系。
2.6.2檢出限的驗證
選擇具有時間和區域特征性的至少3個樣本（與檢出限確定不同樣本）在檢出限濃度水平進行驗證，應達到95%陽性檢出率。
檢出限驗證的樣本型別應覆蓋H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節性H1N1流感病毒、甲型流感病毒H3N2、H5N1和H7N9亞型，乙型流感Yamagata系和Victoria系以及近3年內我國出現的新的流行亞型，具體可參考中國國家流感中心發布的流感監測報告。
應提供詳細的病毒滴度的確定方法，同時應詳細描述病毒樣本的確認方法及驗證結果。
2.7包容性
2.7.1采用生物信息學方法對產品檢測的包容性進行研究，研究應覆蓋已公布的待測類型流感病毒核酸序列。
2.7.2驗證樣本型別應覆蓋H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節性H1N1流感病毒、甲型流感病毒H3N2、H5N1和H7N9亞型，乙型流感病毒Yamagata系和Victoria系以及近3年內出現的新的流行亞型。每種亞型應使用具有時間和區域特征性的不同來源的多例陽性樣本（臨床樣本或病毒培養物）進行研究，應包括檢出限和重復性的驗證。
申請人應提供用于包容性驗證的病毒株的來源、型別確認、滴度確定等信息。
2.8分析特異性
2.8.1交叉反應
用于流感病毒核酸檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發的其他微生物。
建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高。
首先，應在流感病毒不同類型和亞型間進行交叉反應驗證，應使用病毒最高臨床水平濃度進行；其次，采用其他的病原微生物進行驗證（見表1）。
申請人應提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產品說明書的【產品性能指標】項中有所體現。
表1 推薦用于交叉反應性研究的微生物
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博卡病毒 |
肺炎支原體 |
諾卡菌＊ |
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巨細胞病毒 |
腦膜炎奈瑟菌＊ |
粘質沙雷菌＊ |
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單純皰疹病毒1型 |
奈瑟氏菌屬 |
檸檬酸桿菌＊ |
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水痘帶狀皰疹病毒 |
銅綠假單胞菌＊ |
隱球菌＊ |
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EB病毒 |
金黃色葡萄球菌 |
煙曲霉＊ |
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百日咳桿菌 |
表皮葡萄球菌 |
黃曲霉＊ |
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肺炎衣原體 |
肺炎鏈球菌 |
肺孢子菌 |
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棒狀桿菌屬 |
化膿性鏈球菌 |
白念珠菌 |
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大腸桿菌＊ |
唾液鏈球菌 |
粘液羅氏菌＊ |
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流感嗜血桿菌 |
鮑曼不動桿菌＊ |
口腔鏈球菌＊ |
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乳酸桿菌屬 |
嗜麥芽窄食單胞菌＊ |
肺炎克雷伯菌 |
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嗜肺軍團菌 |
洋蔥伯克霍爾德菌＊ |
鸚鵡熱衣原體＊ |
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卡他莫拉菌 |
紋帶棒桿菌＊ |
Q 熱立克次體＊ |
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結核分枝桿菌減毒株＊ |
新型冠狀病毒 2019-nCoV |
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*項：選擇性驗證。
2.8.2競爭性干擾
申請人應充分考慮臨床上容易與流感病毒合并感染的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）流感病毒核酸檢測的影響，進行競爭性干擾研究。
2.8.3干擾物質
應根據所采集樣本類型，針對可能存在的內源/外源物質干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，檢測包含臨界陽性水平和陰性水平在內的常見亞型流感病毒樣本。對結果進行合理的統計分析，對比添加干擾物質前后的Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質及在樣本采集和處理期間引入的物質。
表2 推薦用于干擾研究的物質
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物質 |
活性成分 |
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粘蛋白 |
純化粘蛋白 |
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血液（人類） |
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鼻腔噴霧劑或滴鼻劑 |
苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑） |
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鼻用皮膚類固醇 |
倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松 |
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過敏性癥狀緩解藥物 |
鹽酸組胺 |
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流感疫苗 |
鼻內活流感病毒疫苗 |
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潤喉片、口服麻醉劑和鎮痛劑 |
苯佐卡因、薄荷腦 |
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抗病毒藥物 |
扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋 |
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抗生素、鼻用軟膏 |
莫匹羅星 |
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全身性抗菌藥 |
妥布霉素 |
2.9核酸（RNA）提取/純化性能
在進行核酸檢測之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質量較好的核酸提取試劑進行平行比對。若產品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。
2.10反應體系
2.10.1樣本采集和處理
2.10.1.1樣本采集方式的選擇
2.10.1.2樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。
2.10.1.3采樣拭子及樣本保存液的選擇：對拭子頭和拭子桿的材質要求。明確保存液或裂解液的成分、濃度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗證檢出限和重復性。
2.10.1.4樣本處理方式的選擇：研究產品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學滅活，化學滅活部分應對常見的消毒劑的適用性進行研究。研究樣本前處理方式，包括對不同樣本類型的離心條件的確定研究等。
2.10.2核酸提取和反應體系
研究確定最佳核酸提取和反應體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。建議在保證核酸提取質量的情況下盡量擴大總反應體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。
提交不同適用機型基線和閾值循環數的確定資料。
不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。
3. 穩定性研究
申報試劑的穩定性主要包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開瓶穩定性、機載穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。
4. 陽性判斷值研究
陽性判斷值一般為申報產品檢測病毒核酸陽性的Ct值。陽性判斷值研究用樣本來源應具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的感染階段和生理狀態等因素，盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產品進行陽性判斷值研究。如存在判定值灰區，應提供灰區的確認資料。如采用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應說明這種方法的合理性。提供內標值的確定方法和研究資料。
如果產品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。
提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構、檢測結果等信息。
提供內標檢測結果范圍的確定方法和研究資料。
5. 其他資料
5.1主要原材料研究資料
該類產品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質控品、參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質量控制標準等相關研究資料、質控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業自制，應提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。供應商應固定，不得隨意更換。
5.1.1引物和探針：應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應情況。建議每種病毒設計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應）的評價，其中序列比對包括與已公布流感病毒序列的比對，及與易產生交叉反應的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同滴度的流感病毒核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性試驗等。
5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。
5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別對酶活性、功能性等進行評價和驗證。
5.1.4質控品
試劑盒一般包含陰性質控品和陽性質控品。陽性質控品應包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒等制備。質控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制。提交試劑盒質控品有關原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質控品的檢測結果Ct值范圍做出明確的要求。
5.1.5內標
內標，又稱內對照，可對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內標的引物、探針設計和相關反應體系的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果Ct值范圍。建議科學設置內標，對待測樣本的取樣質量、試劑的反應體系進行監控。
5.企業參考品
該類產品的企業參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復性參考品。應根據產品性能驗證的實際需要設置企業參考品。
應提交企業參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認方法或試劑等相關驗證資料。企業參考品應采用臨床樣本，或者使用病毒培養物加入陰性基質。企業參考品的設置建議如下：
陽性參考品：陽性參考品應設置不同的濃度水平，并應根據申報產品聲稱可檢測流感病毒的類型及亞型情況分別設置，甲型流感病毒應至少包括H1N1、H3N2亞型；乙型流感病毒應包括Victoria系和Yamagta系。
陰性參考品：主要涉及對交叉反應的驗證情況，納入正常臨床樣本、含除待測類型流感病毒外其他類型流感病毒陽性的樣本及含有冠狀病毒、腸道病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等其他病原體陽性的樣本。
檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。應針對申報產品聲稱可檢出的不同類型流感病毒分別設置。
精密度參考品：建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應為檢出限附近的濃度。應針對申報產品聲稱可檢出的不同類型流感病毒分別設置。
5.2生產工藝研究資料
介紹產品主要生產工藝，可用流程圖結合文字的方式表述。提交主要生產工藝的確定及優化研究資料。
（四）臨床評價資料
1.臨床試驗機構
申請人應選擇至少3家備案的醫療器械臨床試驗機構開展臨床試驗。考慮到流感病毒不同病毒株的區域性特征較強，建議申請人在國內不同區域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本具有一定的區域代表性；臨床試驗機構應具有呼吸道疾患診療、病毒分離培養鑒定方法或分子生物學方法檢測的優勢，在整個實驗中，試驗體外診斷試劑（以下稱考核試劑）和對比方法都應處于有效的質量控制下，最大限度保證實驗數據的準確性及可重復性。
2.臨床試驗適用人群和樣本類型
臨床試驗應按照入組標準納入受試者，應選擇具有流感癥狀/體征(如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉疼痛、發燒、頭疼或肌痛等)、流感相似癥狀或有密切接觸史的人群作為適用人群，應盡量覆蓋各個年齡段人群。對于通用型甲型、乙型流感病毒核酸檢測試劑，臨床試驗人群應至少涵蓋近3年主要流行亞型，可參考中國國家流感中心的流感監測報告。
對于甲型流感病毒新亞型試劑，臨床試驗所選擇病例除甲型流感病毒新亞型感染者及密切接觸者外，還應包括其他當年流行的季節性流感病毒感染患者、非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者等。其臨床試驗應能夠體現該產品對甲型流感病毒新亞型檢測的特異性。
臨床試驗應對考核試劑聲稱的各種樣本類型分別進行驗證，應采用臨床原始樣本進行臨床試驗，臨床樣本的處理和保存等應分別滿足考核試劑及對比試劑說明書的相關要求。
3.臨床試驗對比方法
3.1 對于已有同類產品上市的試劑，選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，采用考核試劑與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優于已上市產品。
3.2 對于無同類產品上市的新亞型試劑，臨床試驗對比方法應以核酸序列測定為主，輔以病毒分離培養鑒定。其中，用于核酸序列測定的引物應不同于考核試劑的引物。
3.3對于無同類產品上市的新樣本類型試劑，在充分考慮樣本類型差異的前提下，臨床試驗對比方法可選擇3.2小節的對比方法，也可選擇樣本類型等具有可比性的已上市同類產品。
4.臨床試驗最低樣本量
目前常見的樣本類型為咽拭子，下述樣本量估算均以咽拭子樣本為例。如涉及其他樣本類型，應充分考慮各樣本類型之間的差異。如樣本類型差異較大，應分別進行樣本量估算。
4.1 對于已有同類產品上市的試劑
建議采用單組目標值法進行最低樣本量的估算，通過陽性和陰性符合率分別估算陽性和陰性樣本量，并詳細描述各參數的確定依據。陽性和陰性符合率的臨床可接受標準（P0）建議不低于90%。當評價指標P接近100%時，該樣本量估算方法可能不適用，應考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統計學分析，如精確概率法等。
4.2 對于無同類產品上市的新亞型試劑
以核酸序列測定作為對比方法時，可參考4.1小節樣本量的估算方法。
以病毒分離培養鑒定作為對比方法時，建議采用抽樣調查公式進行最低樣本量的估算，通過臨床靈敏度和特異度分別估算陽性和陰性樣本量，并詳細描述各參數的確定依據。臨床靈敏度的預期值建議不低于95%，臨床特異度預期值的設定應有充分依據。
4.3 對于無同類產品上市的新樣本類型試劑
如選擇3.2小節所述對比方法，可參考4.2小結樣本量的估算方法。
如選擇具有可比性的已上市同類產品作為對比試劑，可參考4.1小節樣本量的估算。
5.統計學分析
常選擇交叉四格表形式總結兩種方法的結果，評價陽性符合率/陰性符合率、靈敏度/特異度，并計算相應的95%置信區間。不同樣本類型和不同對比方法均應分別進行統計分析。對各臨床試驗機構的病例數、年齡分布情況進行分類匯總。
對兩種試劑檢測結果不一致的樣本，應采用臨床參考標準或臨床上普遍認為質量較好的第三種同類試劑進行復核，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。
6.其他
對于已批準上市的甲型流感病毒核酸（通用型）檢測試劑，如在其注冊證有效期內出現了甲流病毒新亞型的暴發流行，建議申請人對甲流病毒新亞型進行臨床試驗，可采用針對甲型流病毒新亞型的病毒培養鑒定或臨床參考標準作為對比方法，分別對來自甲型流感病毒新亞型感染、其他常見的流感病毒亞型（如當年流行的季節性甲型流感病毒）及非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者的新鮮樣本進行比對試驗。申請人應針對產品預期用途覆蓋病毒亞型的變化提出變更注冊申請，按照法規要求提交臨床試驗等資料。
7.境外臨床試驗數據的認可
境外臨床試驗數據應符合《接受醫療器械境外臨床試驗數據技術指導原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數據的注冊審查指導原則》的相關要求。應提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見，以及該數據適用于中國患者人群的論證資料、境內外臨床試驗質量管理差異的對比資料和臨床試驗質量管理差異對于臨床試驗結果影響的論證資料。
申請人應根據上述臨床試驗技術審評要求，論證境外臨床試驗數據的充分性。
8.臨床試驗方案
臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構的方案設置應一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。
試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的對比試劑應完全一致，以便進行合理的統計學分析。另外，考核試劑的樣本類型不應超越對比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了對比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應選擇病毒分離培養鑒定或其他合理方法對額外的樣本類型進行驗證。
9.臨床試驗小結和報告
臨床試驗小結和報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。
（五）產品說明書和標簽樣稿
產品說明書格式應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求。產品說明書中技術內容應與注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，應以規范格式進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。流感病毒核酸檢測試劑說明書編寫應重點關注以下內容。
1.【預期用途】 應至少包括以下幾部分內容：
1.1試劑盒用于定性檢測人口咽拭子、鼻咽拭子、鼻拭子、痰液、抽吸液等呼吸道分泌物樣本（根據具體情況描述）中X型流感病毒核酸（根據實際情況描述）。
1.2簡單介紹待測目標的特征，如病毒種系淵源、生物學性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床表現、待測靶基因特征等。
1.3待測人群特征介紹：具有流感樣癥狀的患者、相關的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等。
1.4本試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標準。建議結合患者臨床表現和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。
2.【檢驗原理】
簡述試劑盒技術原理，及核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位；介紹引物及探針設計/對照品（質控品）設置及熒光信號標記等。明確內標基因名稱及其作用。如添加了相關的防污染組分，也應對其作用機理作適當介紹。
3.【主要組成成分】
明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產品名稱，生產廠家，貨號及注冊證號、備案號等信息。
4.【儲存條件及有效期】
試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數(如適用)要求等，應與相應的穩定性研究結論一致。
5.【適用儀器】
注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。
6.【樣本要求】 重點明確以下內容：
需詳細描述樣本采集和處理方式，包括采樣時間點的選擇、采集部位及類型、采樣步驟，適用的拭子材質，保存液、消化液的使用體積，滅活方式等。描述樣本及核酸提取液的保存穩定性。
7.【檢驗方法】
明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽性質控品與待測樣本同步進行核酸提取操作。明確各適用機型的反應參數設置。明確質控品和內標的檢測結果Ct值范圍，作為實驗有效性的標準。
8.【檢驗結果的解釋】
通過擴增曲線和Ct值進行結果陰陽性的判斷，列明結果陰性、陽性、復測、無效等所有情形。
9.【檢驗方法局限性】
9.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。
9.2有關假陰性結果的可能性分析
9.2.1不合理的樣本采集、轉運及處理、樣本中病毒滴度過低均有可能導致假陰性結果。
9.2.2流感病毒待測靶序列的變異或其他原因導致的序列改變可能會導致假陰性結果。
9.2.3對于突發的新型流感病毒，其檢測的最適樣本類型及感染后的最佳采樣時間可能尚未確認，因此，在同一患者分次、多部位采集樣本會降低假陰性結果的可能性。
9.2.4未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子，可能會導致假陰性結果（如有）。
9.3有關假陽性結果的可能性分析
9.3.1 如果樣本在運輸、處理過程中發生交叉污染，則可能導致假陽性結果；
9.3.2 實驗環境有PCR產物等氣溶膠污染，則可能導致假陽性結果；
9.3.3 實驗過程中使用的耗材、設備等受污染，則可能導致假陽性結果。
9.3.4取標本期間，接種減毒活疫苗的患者可能會導致檢測試劑檢測結果呈陽性
10.【產品性能指標】詳述以下性能指標：
10.1國家標準品（如有）和企業參考品的符合情況。對于甲型流感通用型核酸檢測試劑，應列出所有驗證過的甲型流感病毒各亞型病毒株的信息。
10.2檢出限：簡要介紹評價方法、所用樣本情況以及評價結果。
10.3對包容性的研究情況進行總結。
10.4精密度：對精密度的研究情況進行總結。
10.5分析特異性
10.5.1甲型流感病毒各亞型間的交叉反應驗證：針對甲型流感病毒亞型檢測的試劑盒，則應對較常見的除目的基因外的其他亞型進行交叉反應驗證并對結果進行合理分析；
10.5.2交叉反應：易產生交叉反應的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經過交叉反應驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息；
10.5.3干擾試驗：說明驗證的干擾物質種類及有/無干擾反應的濃度水平。
10.6臨床試驗：簡要介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結果和結論等。
11.【注意事項】應至少包括以下內容：
11.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出生物安全性的警告。
11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。
11.3強調產品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產品性能。
11.4避免實驗室污染的措施
11.5試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導致性能變化，如保存運輸不當、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規范等，請嚴格按照說明書操作。因拭子等樣本采集過程及病毒感染過程本身的特點，可能存在采集到的樣本量不足等原因帶來的假陰性結果，應結合臨床其他診療信息綜合判斷，必要時復測。
三、參考文獻：
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[9]中國成人流行性感冒診療規范急診專家共識（2019）
[10]兒童流行性感冒中西醫結合防治專家共識（2021）
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[13]Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline. NCCLS, MM6-A, Vol. 23 No.28. ISBN 1-56238-508-9.
[14]Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assays; Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute (Formerly NCCLS), MM17-A, Vol.28 No.9, ISBN 1-56238-661-1.
來源：中國器審
